聯(lián)系我們
本案例基于普健生物大腸桿菌表達系統，采用pET28b載體，融合表達了結核分枝桿菌的3個(gè)蛋白(A+B+C，中間用GGGGS接頭連接，N端添加6*His標簽用于蛋白純化)作為免疫原免疫了2只新西蘭大白兔，構建了庫容高達1.56×10^10 CFU的噬菌體展示兔scFV抗體文庫，并用A-B-C蛋白作為篩選原，淘選得到了4條不同的針對A蛋白的抗體序列交付客戶(hù)。
1.抗原制備
A蛋白分析：
A蛋白一共228AAs; 1-23 AAs為信號肽，分子量22kDa，疏水性一般; 普健生物選取的表達區段為23-228 AAs;
蛋白A信號肽分析結果：
蛋白A疏水性分析結果：
B蛋白分析：
B蛋白一共95AAs，無(wú)信號肽，9.9kDa，有2個(gè)跨膜區，疏水性很強; 普健生物選取的表達區段為全長(cháng);
蛋白B結構示意圖
C蛋白分析：
C蛋白一共100 AAs; 無(wú)信號肽，分子量10.79 kDa，有1個(gè)無(wú)序區，疏水性較強; 普健生物選取的表達區段為全長(cháng);
蛋白C結構示意圖
表達的融合蛋白序列示意圖如下：
>His-A-B-C(421 AAs;44.97 kDa;pI:4.85)
MGSHHHHHHSG-A-GGGGS-B-GGGGS-C
通過(guò)密碼子優(yōu)化及基因合成，亞克隆，表達純化，得到的融合蛋白質(zhì)檢圖如下：
A. 考馬斯亮藍染色. B. His 標簽抗體WB鑒定蛋白 (ECL曝光).
緩沖液：PBS pH7.5; 純度：>90%; 濃度:1mg/ml
2.兔scFv抗體庫構建
(1)免疫新西蘭大白兔
將融合蛋白免疫兩只兔子，共免疫四次，免疫間隔兩周，檢測第三次和第四次的免疫效價(jià)，效價(jià)達到要求后(大于 1:32000)進(jìn)行采血，效價(jià)結果如下：
|
稀釋比例 |
兔子 A |
兔子B |
||||
|
免疫前血清 |
3免血清 |
4免血清 |
免疫前血清 |
3免血清 |
4免血清 |
|
|
500 |
0.02 |
2.94 |
3.14 |
0.04 |
3.04 |
3.16 |
|
1000 |
0.01 |
2.73 |
2.93 |
0.02 |
2.93 |
2.94 |
|
2000 |
0.01 |
2.20 |
2.30 |
0.01 |
2.80 |
2.30 |
|
4000 |
0.01 |
1.84 |
1.94 |
0.01 |
1.94 |
1.93 |
|
8000 |
0.01 |
1.34 |
1.64 |
0.01 |
1.64 |
1.65 |
|
16000 |
0.01 |
1.15 |
1.55 |
0.01 |
1.45 |
1.55 |
|
32000 |
0.01 |
0.68 |
0.78 |
0.01 |
0.78 |
0.79 |
|
64000 |
0.01 |
0.43 |
0.63 |
0.01 |
0.63 |
0.65 |
|
128000 |
0.01 |
0.20 |
0.40 |
0.01 |
0.50 |
0.42 |
|
256000 |
0.01 |
0.11 |
0.21 |
0.01 |
0.13 |
0.24 |
|
512000 |
0.01 |
0.06 |
0.20 |
0.01 |
0.06 |
0.21 |
|
0 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
(2)抗體文庫構建
總 RNA 提取(全血和淋巴細胞)，RNA提取結果如下：
圖1.總 RNA凝膠電泳圖.
M: 10kb DNA Ladder, 1: 兔子A總RNA; 2: 兔子B總RNA.
反轉錄獲得 cDNA，可變區片段擴增并克隆至 M13 噬菌粒，2步法建庫，先連入輕鏈，再連入重鏈，輕鏈( VK和 Vλ )酶切結果如下：
M: DL2000
1: A兔子VK 片段; 2: A兔子VK 片段(NheI, NotI)
3: A兔子Vλ 片段; 4: A兔子Vλ 片段 (NheI, NotI)
5: B兔子VK 片段; 6: B兔子VK 片段 (NheI, NotI)
7: B兔子Vλ片段; 8: B兔子Vλ片段.
原始載體酶切結果如下：
圖3.pATA-scFv-2 載體酶切 結果(NheI, NotI, KpnI).
M: 1kb DNA Ladder , 1: pATA-scFv-2 , 2: pATA-scFv-2(NheI, NotI, KpnI)
將輕鏈載體轉化 TG1 ，構建噬菌體文庫，對單克隆進(jìn)行菌落 PCR 分析，挑選陽(yáng)性克進(jìn)行測序，PCR鑒定結果如下：
圖 4. PCR鑒定48個(gè)克隆結果
M: DL2000, 1-24: pATA-VK; 25-48: pATA-Vλ.
將PCR陽(yáng)性的克隆測序，測序引物為 M13-48，得到的輕鏈文庫庫容如下：
pATA -VK 噬菌體抗體庫庫容 =1.44×10^9 cfu,
pATA -Vλ 噬菌體抗體庫庫容 =1.43×10^9 cfu。
將重鏈酶切后連入輕鏈載體構建scFV文庫，輕鏈載體酶切結果如下：
M: 1 kb DNA Ladder
1: pATA-VK;2:pATA-VK(SfiI, XhoI) ;3:pATA-Vλ;4: pATA-Vλ(SfiI, XhoI)
重鏈片段酶切結果如下：
M: DL2000 , 1: VH 片段, 2:VH 片段(SfiI, XhoI)
將重鏈分別連入輕鏈(K和λ)載體后轉化TG1進(jìn)行scFV文庫克隆PCR鑒定，結果如下：
M: DL2000, 1-48: pATA-scFv-KH.
M: DL2000, 1-48: pATA-scFv-λH
最后構建的pATA-scFv-VH庫容如下：
pATA-scFv-KH 噬菌體展示文庫庫容 =1.56×10^10 cfu,
pATA-scFv-λH 噬菌體展示文庫庫容=1.03×10^10 cfu。
3. scFV抗體文庫固相淘選
將得到的融合蛋白A-B-C 按照下表條件進(jìn)行淘選：封閉，噬菌體-抗原反應，洗脫，測定滴度。
表2 每一輪淘選條件
|
輪數 |
包被抗原(μg/mL) |
封閉緩沖液 |
洗滌次數 |
洗脫產(chǎn)物(ul) |
|
1 |
A-B-C (50) |
5% milk/PBST |
5 |
800 |
|
2 |
A-B-C (50) |
5% milk/PBST |
5 |
700 |
|
3 |
A-B-C (50) |
1% Casein/PBST |
5 |
600 |
|
4 |
A-B-C (100) |
5% milk/PBST |
5 |
600 |
|
5 |
A-B-C (100) |
1% Casein/PBST |
6 |
600 |
重復5輪，根據結果判斷是否有特異性富集：
表3. 淘選結果
|
輪數 |
蛋白 |
投入(pfu) |
輸出(pfu) |
|
1 |
A-B-C (50) |
1×1012 |
1.1×107 |
|
2 |
A-B-C (50) |
4.4×1011 |
1.7×108 |
|
3 |
A-B-C (50) |
2×1012 |
3×106 |
|
4 |
A-B-C (100) |
8.5×1011 |
3×106 |
|
5 |
A-B-C (100) |
3×1011 |
1.2×107 |
(3)多克隆ELISA實(shí)驗驗證，結果如下：
表4. 多克隆噬菌體ELISA結果（Ag:A-B-C；NC: PBS）
|
噬菌體 （pfu/ml） |
1輪 |
2輪 |
3輪 |
4輪 |
5輪 |
|||||
|
抗原 |
陰性 對照 |
抗原 |
陰性 對照 |
抗原 |
陰性 對照 |
抗原 |
陰性 對照 |
抗原 |
陰性 對照 |
|
|
1×1012 |
0.34 |
0.20 |
0.30 |
0.22 |
1.16 |
0.31 |
0.88 |
0.12 |
4.20 |
0.18 |
|
3.16×1011 |
0.22 |
0.28 |
0.20 |
0.13 |
1.55 |
0.30 |
1.68 |
0.12 |
3.21 |
0.11 |
|
1×1011 |
0.26 |
0.20 |
0.13 |
0.09 |
0.89 |
0.52 |
2.56 |
0.07 |
2.19 |
0.09 |
|
3.16×1010 |
0.24 |
0.13 |
0.09 |
0.07 |
0.37 |
0.32 |
1.42 |
0.07 |
1.56 |
0.09 |
|
1×1010 |
0.23 |
0.14 |
0.07 |
0.07 |
0.22 |
0.52 |
1.03 |
0.03 |
1.02 |
0.04 |
|
3.16×109 |
0.21 |
0.13 |
0.10 |
0.07 |
0.15 |
0.18 |
0.40 |
0.03 |
0.61 |
0.04 |
|
1×109 |
0.17 |
0.18 |
0.11 |
0.11 |
0.14 |
0.31 |
0.24 |
0.02 |
0.35 |
0.05 |
|
blank |
0.25 |
0.17 |
0.13 |
0.15 |
0.18 |
0.32 |
0.05 |
0.04 |
0.03 |
0.07 |
根據以上結果，我們選取了第3/4/5輪淘選所得噬菌體進(jìn)行了單克隆ELISA檢測：
表5.單克隆ELISA結果（抗原-R3P1）-抗原: A-B-C ；陰性對照: PBS
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
|
A |
0.07 |
0.06 |
0.07 |
0.11 |
0.07 |
0.11 |
0.19 |
0.23 |
0.23 |
0.26 |
0.28 |
0.38 |
|
B |
0.09 |
0.05 |
0.09 |
0.10 |
0.12 |
0.12 |
0.15 |
0.24 |
0.19 |
0.24 |
0.33 |
0.39 |
|
C |
0.07 |
0.04 |
0.08 |
0.08 |
0.07 |
0.13 |
0.21 |
0.16 |
0.27 |
0.25 |
0.29 |
0.46 |
|
D |
0.07 |
0.06 |
0.06 |
0.05 |
0.11 |
0.22 |
0.11 |
0.16 |
0.26 |
0.31 |
0.34 |
0.41 |
|
E |
0.06 |
0.03 |
0.05 |
0.04 |
0.16 |
0.11 |
0.06 |
0.06 |
0.21 |
0.33 |
0.36 |
0.33 |
|
F |
0.07 |
0.06 |
0.05 |
0.09 |
0.16 |
0.14 |
0.16 |
0.19 |
0.17 |
0.27 |
0.16 |
0.28 |
|
G |
0.06 |
0.07 |
0.06 |
0.09 |
0.11 |
0.14 |
0.06 |
0.19 |
0.34 |
0.32 |
0.45 |
0.19 |
|
H |
0.08 |
0.09 |
0.08 |
0.23 |
0.23 |
0.27 |
0.21 |
0.30 |
0.21 |
0.39 |
0.38 |
0.21 |
表6.陰性對照結果 (NC-R3P1)
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
|
A |
0.05 |
0.05 |
0.03 |
0.08 |
0.07 |
0.04 |
0.11 |
0.12 |
0.22 |
0.41 |
0.49 |
0.45 |
|
B |
0.05 |
0.08 |
0.04 |
0.11 |
0.06 |
0.06 |
0.08 |
0.12 |
0.15 |
0.44 |
0.33 |
0.44 |
|
C |
0.05 |
0.04 |
0.04 |
0.07 |
0.09 |
0.04 |
0.09 |
0.11 |
0.27 |
0.23 |
0.27 |
0.42 |
|
D |
0.05 |
0.04 |
0.03 |
0.09 |
0.05 |
0.04 |
0.07 |
0.12 |
0.17 |
0.26 |
0.26 |
0.44 |
|
E |
0.04 |
0.03 |
0.03 |
0.04 |
0.05 |
0.06 |
0.06 |
0.12 |
0.24 |
0.13 |
0.16 |
0.34 |
|
F |
0.06 |
0.04 |
0.05 |
0.08 |
0.07 |
0.04 |
0.08 |
0.11 |
0.22 |
0.12 |
0.22 |
0.46 |
|
G |
0.06 |
0.06 |
0.07 |
0.09 |
0.07 |
0.07 |
0.10 |
0.16 |
0.16 |
0.20 |
0.26 |
0.37 |
|
H |
0.07 |
0.09 |
0.06 |
0.12 |
0.10 |
0.09 |
0.15 |
0.21 |
0.19 |
0.21 |
0.33 |
0.36 |
表7.單克隆ELISA(Ag-R4P1)
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
|
A |
0.07 |
0.03 |
0.03 |
0.03 |
0.03 |
0.03 |
0.04 |
0.04 |
0.05 |
0.04 |
0.05 |
0.04 |
|
B |
0.08 |
0.03 |
0.46 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
2.63 |
0.09 |
0.04 |
0.03 |
0.09 |
0.04 |
|
C |
0.12 |
0.02 |
0.03 |
0.02 |
0.03 |
0.02 |
0.02 |
0.03 |
0.05 |
0.03 |
0.07 |
0.03 |
|
D |
0.09 |
0.02 |
0.02 |
0.03 |
0.02 |
0.03 |
0.03 |
0.03 |
0.03 |
3.17 |
0.06 |
0.08 |
|
E |
0.09 |
0.03 |
0.02 |
0.02 |
0.03 |
0.03 |
0.03 |
0.04 |
0.04 |
0.03 |
0.09 |
0.09 |
|
F |
0.12 |
0.04 |
0.03 |
0.02 |
0.04 |
0.03 |
1.69 |
0.05 |
0.04 |
0.03 |
0.04 |
0.10 |
|
G |
0.08 |
0.03 |
0.03 |
0.03 |
0.04 |
0.04 |
0.04 |
0.05 |
0.05 |
0.07 |
0.09 |
0.11 |
|
H |
0.12 |
0.05 |
0.03 |
0.04 |
0.06 |
0.07 |
0.08 |
0.14 |
0.10 |
0.10 |
0.09 |
0.18 |
表 8.單克隆ELISA(NC-R4P1)
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
|
A |
0.03 |
0.03 |
0.04 |
0.03 |
0.04 |
0.03 |
0.04 |
0.04 |
0.10 |
0.11 |
0.14 |
0.22 |
|
B |
0.05 |
0.03 |
0.03 |
0.02 |
0.05 |
0.03 |
0.03 |
0.03 |
0.06 |
0.05 |
0.09 |
0.22 |
|
C |
0.06 |
0.02 |
0.03 |
0.03 |
0.03 |
0.04 |
0.03 |
0.04 |
0.07 |
0.05 |
0.13 |
0.20 |
|
D |
0.05 |
0.03 |
0.03 |
0.03 |
0.04 |
0.03 |
0.03 |
0.03 |
0.04 |
0.05 |
0.12 |
0.26 |
|
E |
0.07 |
0.03 |
0.05 |
0.04 |
0.08 |
0.05 |
0.05 |
0.07 |
0.09 |
0.10 |
0.14 |
0.28 |
|
F |
0.06 |
0.04 |
0.04 |
0.05 |
0.05 |
0.08 |
0.05 |
0.06 |
0.07 |
0.12 |
0.20 |
0.25 |
|
G |
0.08 |
0.03 |
0.03 |
0.03 |
0.06 |
0.03 |
0.05 |
0.06 |
0.04 |
0.04 |
0.05 |
0.22 |
|
H |
0.09 |
0.06 |
0.05 |
0.07 |
0.07 |
0.09 |
0.09 |
0.07 |
0.10 |
0.12 |
0.16 |
0.27 |
表 9.單克隆ELISA(Ag-R5P1)
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
|
A |
0.09 |
0.06 |
0.02 |
0.03 |
1.03 |
0.03 |
0.05 |
0.04 |
2.01 |
0.04 |
0.10 |
2.74 |
|
B |
2.00 |
2.02 |
0.02 |
0.01 |
0.06 |
1.47 |
1.91 |
0.01 |
0.02 |
0.08 |
1.71 |
0.09 |
|
C |
0.03 |
0.02 |
0.01 |
1.46 |
0.01 |
1.02 |
2.27 |
1.80 |
1.60 |
1.59 |
0.02 |
0.08 |
|
D |
1.79 |
0.02 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.22 |
0.01 |
0.01 |
0.06 |
|
E |
0.02 |
1.50 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
1.42 |
1.42 |
|
F |
0.02 |
0.02 |
1.65 |
0.99 |
0.01 |
0.02 |
1.51 |
0.02 |
0.02 |
1.95 |
0.01 |
0.09 |
|
G |
0.03 |
1.83 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.03 |
0.03 |
2.05 |
|
H |
0.14 |
1.66 |
0.10 |
0.67 |
2.16 |
0.12 |
2.24 |
0.10 |
0.11 |
1.89 |
0.13 |
0.27 |
表 10.單克隆ELISA(NC-R5P1)
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
|
A |
0.03 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.04 |
0.03 |
0.03 |
0.04 |
0.04 |
0.06 |
0.05 |
0.06 |
|
B |
0.04 |
0.03 |
0.02 |
0.01 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.04 |
0.02 |
0.10 |
|
C |
0.03 |
0.02 |
0.02 |
0.01 |
0.01 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.01 |
0.02 |
0.04 |
0.14 |
|
D |
0.03 |
0.02 |
0.02 |
0.01 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
0.03 |
0.08 |
|
E |
0.03 |
0.03 |
0.02 |
0.01 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.01 |
0.01 |
0.02 |
0.07 |
|
F |
0.03 |
0.02 |
0.02 |
0.01 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.01 |
0.01 |
0.02 |
0.06 |
|
G |
0.03 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.03 |
0.02 |
0.02 |
0.03 |
0.06 |
|
H |
0.04 |
0.07 |
0.06 |
0.04 |
0.04 |
0.05 |
0.03 |
0.05 |
0.06 |
0.04 |
0.04 |
0.17 |
根據以上結果，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測序，得到了 14條不同的序列,針對14個(gè)陽(yáng)性克隆采用A-B-C和A蛋白(甲方提供)又進(jìn)行了二次驗證，結果如下：
表 11. 二次驗證ELISA結果
|
克隆編號 |
抗原1 |
抗原2 |
陰性對照 |
|
R5P1-A9 |
1.8424 |
0.1964 |
0.1172 |
|
R5P1-A12 |
2.339 |
0.1355 |
0.146 |
|
R5P1-B1 |
2.296 |
0.1848 |
0.1593 |
|
R5P1-B6 |
2.1471 |
0.3191 |
0.309 |
|
R5P1-B11 |
1.868 |
0.2985 |
0.3075 |
|
R5P1-C6 |
2.4653 |
0.3502 |
0.22650 |
|
R5P1-C7 |
3.8706 |
4.0711 |
0.20770 |
|
R5P1-C9 |
3.9672 |
4.441 |
0.14710 |
|
R5P1-C10 |
2.0621 |
0.1691 |
0.2446 |
|
R5P1-E12 |
1.956 |
0.1201 |
0.2052 |
|
R5P1-F10 |
1.9198 |
0.2083 |
0.3152 |
|
R5P1-G2 |
3.4017 |
3.3381 |
0.3472 |
|
R5P1-G12 |
2.5475 |
0.3953 |
0.4183 |
|
R5P1-H4 |
2.0672 |
2.7704 |
0.5009 |
根據以上結果，得到了4條針對蛋白A的序列，序列略(保密)。
4. 抗體重組表達
將得到的4個(gè)抗體重鏈和輕鏈可變區序列分別和兔重鏈恒定區和輕鏈恒定區(kappa)序列連接后基因合成，分別亞克隆到普健生物自有表達載體pATX2，共轉XtenCHO細胞，收集培養上清后進(jìn)行Protein A純化，得到的抗體采用SDS-PAGE進(jìn)行質(zhì)檢，純度結果如圖所示：
圖9. 重組抗體質(zhì)檢圖. 考馬斯亮藍
A. 還原PAGE. B. 非還原PAGE.
MW. 蛋白Marker.
相關(guān)服務(wù)
