酵母表達系統

畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統是近年來(lái)發(fā)展迅速、應用廣泛的一種真核表達系統。它是甲醇營(yíng)養型酵母菌，有兩個(gè)乙醇氧化酶(Alcohol oxidase，AOX)編碼基因AOX1和AOX2，兩者序列相似，AOX1基因嚴格受甲醇誘導和調控。當甲醇為唯一碳源時(shí)，AOX1啟動(dòng)子可被甲醇誘導，啟動(dòng)乙醇氧化酶的表達，從而用甲醇進(jìn)行代謝，含AOX1啟動(dòng)子的質(zhì)?？捎脕?lái)促進(jìn)編碼外源蛋白的目的基因的表達。

主要優(yōu)勢：

1.含有特有的強有力的AOX(醇氧化酶基因)啟動(dòng)子，用甲醇可嚴格地調控外源基因的表達

2.產(chǎn)物易分離，畢赤酵母所用發(fā)酵培養基十分廉價(jià)，一般碳源為甘油或葡萄糖及甲醇，其余為無(wú)機鹽，培養基中不含蛋白，有利于下游產(chǎn)品分離純化

3.外源蛋白基因遺傳穩定，外源基因能以高拷貝數整合到畢赤酵母基因組中，不易丟失并能夠得到高表達菌株

4.作為真核表達系統，畢赤酵母具有真核生物的亞細胞結構，具有糖基化、脂肪?；?、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能

表達菌株特點(diǎn)：

GS115：AOX1和AOX2基因都正常表達AOX蛋白(乙醇氧化酶)，甲醇的利用效率高，接近于野生型，屬于甲醇快速利用型(Mut+)

KM71：AOX1基因被大部分剔除，只能利用AOX2為AOX編碼，甲醇利用速率變慢，表現為甲醇慢利用型(Muts)

外源基因的整合方式不同會(huì )導致表達菌株的表型不同：

Table 1. 酵母菌株表型

Table 2. 表達載體信息

對于胞外表達的蛋白除了可以用載體自帶的信號肽，還有以下信號肽可供選擇：

Table 3 . 信號肽序列

1.具有完備的畢赤酵母表達平臺，可以根據蛋白特性或客戶(hù)需求設計不同的實(shí)驗方案

2.具有高通量篩選平臺，可以快速有效地獲得最佳表達條件

3.具有大規模發(fā)酵生產(chǎn)的能力

案例1：

　　蛋白A全長(cháng)基因合成后亞克隆至表達載體pPICZαA，轉化畢赤酵母菌株X33，蛋白分泌表達成功(28kDa;C端6*His)，產(chǎn)量7mg/L，純度大于90%，質(zhì)檢圖如下：

蛋白A 純化質(zhì)檢圖（Reduced SDS-PAGE）

案例2：

　　蛋白B基因合成后亞克隆至表達載體pPIC3.5K分別轉化畢赤酵母菌株GS115/KM71進(jìn)行胞內表達，SDS-PAGE檢測結果顯示蛋白B(糖基化后40kDa)有明顯表達，其中克隆GS115-5#(24h，0.5%甲醇)，GS115-2#(48h，1%甲醇)，GS115-3#(48h，1%甲醇)都能成功表達目的蛋白。

蛋白 B 表達測試圖（Reduced SDS-PAGE）