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上篇流式小課堂的第一期，我們帶大家簡(jiǎn)單了解流式檢測平臺【第一期】流式小課堂。從本篇開(kāi)始我們將以 step by step 的方式各個(gè)擊破關(guān)于流式實(shí)驗的相關(guān)難點(diǎn)。
我們知道流式細胞術(shù)是基于特定激光激發(fā)下，細胞產(chǎn)生的熒光被流式儀接收器接收。那么流式儀所接收的光信號一定就是應該素被激發(fā)之后所產(chǎn)生的嗎？答案是否。這里我們要引入一個(gè)概念---非特異性熒光。所謂非特異性熒光是指：細胞表面的某些分子或者結構能夠產(chǎn)生熒光，這種熒光相對于熒光素產(chǎn)生的熒光較弱，并且與細胞表面的特異抗原分子沒(méi)有相關(guān)性。由于非特異性熒光的存在，在特定激光激發(fā)下，細胞產(chǎn)生的熒光并不是絕對的有或者無(wú)，細胞表面不結合流式熒光素也會(huì )產(chǎn)生熒光信號。這就給我們分析流式結果時(shí)帶來(lái)了一定的難度，相當于我們通過(guò)流式檢測時(shí)得到的熒光信號是細胞本身的非特異性熒光和來(lái)自于細胞表面結合的熒光素的特異性熒光疊加得到的結果。
陰性對照
由于存在光信號疊加，因此在分析流式結果時(shí)我們需要比較熒光信號與細胞的非特異性熒光。如果得到的熒光信號大于非特異性熒光，說(shuō)明得到的熒光信號部分來(lái)源于熒光素的特異性熒光，就可以得出細胞表達相應的抗原分子的結論。所以，確定與熒光素無(wú)關(guān)的細胞自身的非特異性熒光的強弱非常重要，設立陰性對照就是為了確定細胞的非特異性熒光。
上圖為3類(lèi)陰性對照和標記熒光素偶聯(lián)抗體(抗CD69-PE)得到的熒光信號的示意圖。相比于前面3類(lèi)陰性對照，可以得出這群樣品細胞中有30％的細胞表達有CD69抗原分子。如果沒(méi)有陰性對照作為參照，直接根據最后標記熒光素偶聯(lián)抗體組的熒光信號無(wú)法判斷樣品細胞中有多少比例的細胞表面結合有PE熒光素，從而也就無(wú)法判斷有多少比例的細胞表達CD69抗原分子。
第1類(lèi)
negative
“negative”表示的是不加任何熒光素偶聯(lián)抗體時(shí)得到的熒光信號，因為沒(méi)有標記任何熒光素，所以這組得到的熒光信號與熒光素無(wú)關(guān)，與細胞抗原分子是否表達無(wú)關(guān)，得到的熒光信號代表的是非特異性熒光信號；
第2類(lèi)
抗CD69
“抗CD69”表示的是用抗CD69抗體標記樣品細胞后得到的熒光信號，雖然抗CD69抗體能夠與細胞表面的CD69抗原分子結合，但是抗CD69抗體沒(méi)有偶聯(lián)熒光素，所以得到的熒光信號也與細胞表面是否表達有CD69分子無(wú)關(guān)，得到的熒光信號代表的也只是細胞本身的非特異性熒光，所以這種對照用于排除抗體的影響；
第3類(lèi)
IgG1-PE
“IgG1-PE”表示的是標記與抗CD69抗體同種屬（來(lái)源于同一物種）且同類(lèi)（抗CD69-PE中的抗體是IgG1類(lèi)的）的非特異性抗體（IgG1）與PE熒光素偶聯(lián)的同型（isotype）對照抗體（IgG1-PE）后，得到的熒光信號，這種同型對照抗體不能與細胞表面的CD69發(fā)生特異性結合，所以細胞表面不會(huì )結合有IgG1-PE，最后得到的熒光信號不是PE熒光素產(chǎn)生的特異性熒光信號，而是代表細胞本身的非特異性熒光，所以這種對照用于排除熒光素的影響。第3類(lèi)同型對照抗體就是我們在流式實(shí)驗中最常設置的同型對照。
FMO對照
減一陰性對照（Fluorescence-minus-onecontrol，FMO對照）是一種特殊的陰性對照，是指在多色（通道）分析時(shí)對其中某一個(gè)通道特別設置的陰性對照，多在研究不同細胞亞群表達某些重要的表型分子、細胞因子等時(shí)應用。
如需要研究人外周血單個(gè)核細（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中CD62L+CD4+和CD62L-CD4+兩個(gè)細胞亞群表達CD45RA這個(gè)重要表型分子的表達情況時(shí)，需要同時(shí)標記不同熒光素偶聯(lián)的抗人CD4、CD62L和CD45RA抗體，除了常規的陰性對照設置，最好再設置一組FMO對照，就是只標記熒光素偶聯(lián)抗人CD4和CD62L抗體，而不標記熒光素偶聯(lián)的抗人CD45RA抗體，然后將CD62L+CD4+和CD62L-CD4+細胞亞群分別設門(mén)，將兩群細胞分別顯示于新的散點(diǎn)圖中，散點(diǎn)圖上其中一個(gè)軸代表CD45RA的熒光信號，這時(shí)就可以分別設置這兩個(gè)細胞亞群CD45RA通道的陰陽(yáng)性界線(xiàn)，然后再上樣分析實(shí)驗組，根據不同細胞亞群各自的陰陽(yáng)性界線(xiàn)分別判定細胞亞群各自表達CD45RA的情況。這種特殊的陰性對照就是FMO對照。因為不同細胞亞群的非特異性熒光可能存在差異，而且不同細胞亞群結合有不同的熒光素偶聯(lián)抗體從而使它們的最佳補償值存在差異，當在統一的補償條件下同時(shí)分析時(shí)，不同細胞亞群在某一通道的陰陽(yáng)性界線(xiàn)就可能存在差異，普通陰性對照無(wú)法進(jìn)一步區分這種差異，而FMO對照就可以通過(guò)只缺少標記這一通道代表的熒光素偶聯(lián)抗體，精確界定不同細胞亞群各自的這一通道的陰陽(yáng)性界線(xiàn)，從而使流式分析結果更加精確。
陽(yáng)性對照
說(shuō)完了陰性對照，我們來(lái)講講陽(yáng)性對照的設置。流式實(shí)驗的陽(yáng)性對照，是指在使用某種熒光素偶聯(lián)抗體前先檢測該熒光素偶聯(lián)抗體是否有效。
陽(yáng)性對照并不是每次流式分析時(shí)都必須設置，以下是需要設置陽(yáng)性對照的情況，給大家參考判斷：
1.使用新的熒光素偶聯(lián)抗體時(shí)，該熒光素偶聯(lián)抗體以前沒(méi)有使用過(guò)。
2.換用不同公司的或者同一公司但不同批號的熒光素偶聯(lián)抗體時(shí)。
3.使用儲存時(shí)間較長(cháng)的熒光素偶聯(lián)抗體時(shí)。
當出現以上三種情況時(shí)，熒光素偶聯(lián)抗體會(huì )因為失效而導致無(wú)法與抗原分子結合產(chǎn)生特異性的熒光信號，從而得到一個(gè)假陰性的結果。
設置陽(yáng)性對照通常我們使用以下兩種方法：
01
肯定表達有相應抗原分子的樣品細胞來(lái)檢測，如檢測熒光素（不管哪種熒光素）偶聯(lián)的抗小鼠CD4抗體，可以用該抗體標記正常小鼠的脾臟細胞，因為該細胞內肯定有CD4陽(yáng)性細胞，而且已知CD4陽(yáng)性細胞占脾臟細胞的大致比例范圍，所以如果用該抗體標記脾臟細胞得到意料中的結果時(shí)，就可以認為該抗體有效；
02
如果實(shí)驗室有已證明有效地與待測熒光素偶聯(lián)抗體的單克隆抗體相同但偶聯(lián)的熒光素不同的熒光素偶聯(lián)抗體，如需檢測FITC偶聯(lián)的抗小鼠CD4抗體（FITC-CD4抗體）是否有效，實(shí)驗室已有證明有效的PE偶聯(lián)的抗小鼠CD4抗體（PE-CD4抗體），這時(shí)可以用這兩種熒光素偶聯(lián)抗體同時(shí)標記同一份肯定表達有相抗原分子（CD4分子）的樣品細胞，流式檢測后如果PE陽(yáng)性的細胞FITC也是陽(yáng)性的，PE陰性的細胞FITC也是陰性的，就可以證明該待測的熒光素偶聯(lián)抗體有效。
以上就是關(guān)于流式實(shí)驗中對照設置的相關(guān)知識，下一篇我們將繼續介紹流式實(shí)驗如何選擇流式細胞術(shù)常用的熒光素。敬請期待~
關(guān)于普健
普健生物（AtaGenix）于2012年在武漢成立，作為武漢國家生物產(chǎn)業(yè)基地公共服務(wù)平臺—光谷抗體發(fā)現與篩選公共服務(wù)平臺。普健生物（AtaGenix）專(zhuān)注于重組蛋白、抗體、診斷原料、抗體藥物發(fā)現等自主技術(shù)平臺的建設和下游生物醫藥產(chǎn)品的戰略合作。經(jīng)過(guò)10年的發(fā)展，普健生物已成為一家立足武漢，業(yè)務(wù)覆蓋全國、輻射全球的高新技術(shù)服務(wù)企業(yè)。目前公司擁有4200平米自建實(shí)驗室（包含800平高標準BSL-2級細胞房），擁有齊全蛋白抗體開(kāi)發(fā)設備500余套，包括高通量蛋白純化儀、Agilent 流式細胞分析儀，全自動(dòng)HPLC分析儀，openSPR蛋白、抗體親和力測定儀，Olympus熒光顯微鏡， BTX電融合儀，微生物發(fā)酵罐，中試型高壓均質(zhì)機，全自動(dòng)管式化學(xué)發(fā)光儀，以及配套的高速離心機，細胞計數儀及大容量細胞培養搖床。公司先后獲得榮譽(yù)：3551人才計劃、高新技術(shù)企業(yè)、技術(shù)先進(jìn)型服務(wù)企業(yè)、光谷瞪羚企業(yè)
