聯(lián)系我們
假如世界上真的有唐僧肉，
我絕對想當妖精。
然而人類(lèi)長(cháng)生不老的問(wèn)題一直懸而未決，
所以，
我們才會(huì )總是問(wèn)活著(zhù)的意義。
為了避諱，
生物學(xué)上的“死亡”，
不同的社會(huì )學(xué)說(shuō)法就有兩百多種。
還有一種叫做“凋亡”，
是生物體組成基本單位——細胞
的消失方式之一，
它完美地詮釋了
一種從容不迫的態(tài)度。
那么，
什么是凋亡呢？
↓
細胞凋亡（Apoptosis）,又稱(chēng)程序性細胞死亡（Programmed Cell Death，PCD），是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結束其生命，有一系列酶參與、由基因控制的一個(gè)主動(dòng)的、高度有序的、非炎癥性細胞死亡的過(guò)程。近年來(lái)已在很多領(lǐng)域如胚胎學(xué)、內分泌學(xué)、免疫學(xué)，尤其是腫瘤學(xué)方面引起廣泛的興趣和關(guān)注，其研究可能有助于闡明腫瘤發(fā)病機理并為其治療提供嶄新的途徑。
細胞凋亡不同于細胞壞死：
細胞凋亡與細胞壞死的區別
壞死（necrosis）是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞無(wú)序變化的死亡過(guò)程，表現為細胞脹大、胞膜破裂、細胞內容物外溢、核變化較慢、DNA降解不充分和引起嚴重的局部炎癥反應等。
凋亡是細胞對環(huán)境的生理性或病理性刺激信號、環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應答有序變化的死亡過(guò)程，是一種基本的細胞生物學(xué)現象，在多細胞生物中起著(zhù)去除不需要細胞或異常細胞的作用。表現為細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現發(fā)泡現象，細胞凋亡期可見(jiàn)凋亡小體。貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落等現象。
原來(lái)如此~
那么小編不禁想問(wèn)，
怎么才能知道一個(gè)細胞是否凋亡呢？
別擔心，
人類(lèi)有很多種檢測細胞凋亡的方法，
下面主要介紹兩種：
細胞凋亡的檢測方法
最直觀(guān)的當然是“看”啦：
1
形態(tài)學(xué)觀(guān)察
光鏡下細胞凋亡最早變化有細胞體積縮小、細胞核固縮、染色體邊集在核膜內側、核碎裂、細胞漿和細胞器密度增高，細胞膜皺折、卷曲、出泡、胞漿膜包裹細胞碎片“凋亡小體”，凋亡小體是細胞凋亡的特征性改變。
電鏡下可見(jiàn)在細胞凋亡的早期細胞核染色體發(fā)生邊集，在細胞核膜周邊聚集成新月體形，隨之染色體發(fā)生固縮、電子密度增強、核形不規整，核碎裂成碎片、細胞體積變小、胞漿濃縮、空泡增多，可見(jiàn)細胞膜丫生出泡現象；在凋亡晚期可見(jiàn)膜泡內有較完整的細胞器和細胞核碎片的凋亡小體。
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凋亡小體的形成示意
除了宏觀(guān)上的定性觀(guān)察，
還有更精確的定量檢測。
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2
生化特征檢測
細胞凋亡最明顯的生化特征是Ca2 + 、Mg2+ 依賴(lài)性?xún)仍葱院怂崦傅募せ顚⒓毎巳旧w從核小體間斷裂，形成由大約為180 - 200bp 或其多聚體組成的寡核苷酸片段。
DNA凝膠電泳法
DNA 凝膠電泳表現在：正?；罴毎?DNA電泳為一條區帶,細胞凋亡時(shí)核酸內切酶將DNA 分解成規則的180-200bp的DNA片段。瓊脂糖凝膠電泳中就呈現特異的梯狀Ladder圖譜，而壞死呈彌漫的連續圖譜。DNA 電泳法的缺點(diǎn)是不能進(jìn)行準確定量，只能進(jìn)行半定量。其靈敏性較差，要求所測標本細胞數在106 以上才能使電泳清晰。實(shí)驗流程如下：收集細胞（5×106-107個(gè)cell ）→ DNA 提?。ǚ勇确?、氯仿抽提）→瓊脂糖凝膠電泳→結果分析。
TUNEL法
TUNEL法（terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling,末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記測定法)也稱(chēng)DNA 斷裂的原位末端標記法，這一方法能對DNA分子斷裂缺口中的3'-OH進(jìn)行原位標記，借助一種可觀(guān)測的標記物(如熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物)，能對凋亡細胞的核DNA中產(chǎn)生的3'-OH末端進(jìn)行原位標記，用熒光顯微鏡即可進(jìn)行觀(guān)察。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒(méi)有 DNA 的斷裂，因而沒(méi)有 3'-OH 形成，很少能夠被染色。TUNEL 實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結合的研究方法，對完整的單個(gè)凋亡細胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態(tài)測定。
Annexin V法
磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為35~36kD 的Ca2 +依賴(lài)性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。將 Annexin-V 進(jìn) 行 熒 光 素（FITC、PE）標 記，以標記了的Annexin-V 作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(propidine iodide ，PI)是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過(guò)細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開(kāi)來(lái)。實(shí)驗流程如下：收集細胞（5×105~106 ）→ 細胞染色（Annexin V，FITC 凋亡檢測試劑盒）→流式細胞儀上機檢測→專(zhuān)業(yè)流式軟件結果分析（如flowjo ）。
Caspase-3活性檢測法
Caspase家族在介導細胞凋亡的過(guò)程中起著(zhù)非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32 kD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基（17 kD）和兩個(gè)小亞基（12 kD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞中，caspase-3的活性明顯下降。實(shí)驗流程：（以Western blot 分析為例）收集細胞→PBS洗滌→蛋白提取→蛋白定量→SDS-PAG電泳→硝酸纖維素膜或PVDF膜轉移→5%脫脂奶粉封閉→一抗孵育（Caspase-3多抗或單抗）→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗滌→二抗孵育→ TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗滌→ECL顯影或NBT/BCIP顯色→結果分析及判定。
幫人幫到底，送佛送到西。
除了告訴你怎么做，我們還會(huì )指點(diǎn)你怎么辦~
且看
常見(jiàn)問(wèn)題
解決方案
1
如何選擇合適的凋亡檢測方法?
定性的研究方法可選DNA電泳法、形態(tài)學(xué)觀(guān)察（普通光學(xué)顯微鏡、透射電鏡、熒光顯微鏡）；定量或半定量的研究方法可選各種流式細胞儀方法、原位末端標記法等。DNA瓊脂糖凝膠電泳法敏感性不高，大量凋亡細胞同時(shí)存在時(shí)才出現典型的結果，且只能用于細胞群體，不能用于組織的原位檢測；TUNEL法可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態(tài)測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用；細胞發(fā)生凋亡時(shí)，膜上的PS外露早于DNA斷裂發(fā)生，因此Annexin V聯(lián)合PI染色法檢測早期細胞凋亡較TUNEL法更為靈敏。并且Annexin V聯(lián)合PI染色不需固定細胞，可避免PI染色因固定造成的細胞碎片過(guò)多及TUNEL法因固定出現的DNA片段丟失。因此，Annexin V聯(lián)合PI法更加省時(shí)，結果更為可靠，是目前最為理想的檢測細胞凋亡的方法。
2
Annexin V法通過(guò)流式細胞儀檢測細胞凋亡時(shí)
沒(méi)有凋亡信號/沒(méi)有早期凋亡信號？
沒(méi)有檢測到凋亡信號說(shuō)明細胞未被染料標記上。不同公司生產(chǎn)的Annexin V、FITC細胞凋亡檢測試劑盒的生產(chǎn)工藝流程都不一樣。首先檢查試劑盒儲存是否正確（4度還是-20度）以及保質(zhì)期；其次檢查是否嚴格按照試劑盒所提供的實(shí)驗說(shuō)明進(jìn)行操作。
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3
Annexin V法通過(guò)流式細胞儀檢測細胞凋亡時(shí)
凋亡信號值過(guò)高？
在實(shí)驗操作過(guò)程中應動(dòng)作輕柔、迅速，避免影響細胞的活力及形態(tài)。在處理貼壁細胞時(shí)應使用不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞，消化時(shí)間不宜太長(cháng)，染色操作完成時(shí)應盡快上機檢測。
