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很多人不知道，抗體藥物研發(fā)，最關(guān)鍵的一步是。。。
咨詢(xún)，問(wèn)對人很重要
一個(gè)雙特異性抗體藥與普健的故事，四年征程，未完待續。。。
那是風(fēng)和日麗的一個(gè)下午，叮咚~
一條消息跳了出來(lái)，“要開(kāi)發(fā)雙特異性抗體藥物，你們有專(zhuān)家嗎？”
“我們的抗體藥物專(zhuān)家經(jīng)驗豐富，曾經(jīng)成功開(kāi)發(fā)過(guò)上市治療性抗體藥物，可以針對具體需求進(jìn)行個(gè)性化設計。AtaGenix將全程為您服務(wù)。”
隨后，一項歷時(shí)四年的工程由此展開(kāi)。
目標：開(kāi)發(fā)一種雙特異性抗體藥物，通過(guò)連接CD3抗體，增強針對某類(lèi)特定腫瘤細胞A的免疫系統識別能力。
要開(kāi)發(fā)雙特異性抗體，我們得先分別獲得抗單種抗原的鼠單抗---CD3抗體和腫瘤抗原A的抗體。然后進(jìn)行雙特異性抗體設計、表達及純化，對正確組裝后的雙抗進(jìn)行檢測，最終實(shí)現大規模生產(chǎn)。
路得一步一步走，每一步都很關(guān)鍵。
這就需要我們的單克隆抗體開(kāi)發(fā)技術(shù)（點(diǎn)擊可查看技術(shù)詳情）。
已知目標蛋白在哺乳動(dòng)物表達系統里很難表達，但我們就是解決困難的。
接下來(lái)，沿著(zhù)單克隆抗體開(kāi)發(fā)流程，看一下我們是怎樣做到的。
經(jīng)過(guò)預測和評估，我們選擇了目標蛋白的一個(gè)片段在哺乳動(dòng)物細胞中進(jìn)行表達。
雖然，該基因是針對哺乳動(dòng)物細胞表達而設計和優(yōu)化的。
但是，我們向來(lái)不只做單一準備，永遠備有為客戶(hù)準備的Plan B。So，除了哺乳動(dòng)物細胞表達系統，我們還選了大腸桿菌作為備用系統。兩種表達方案同時(shí)進(jìn)行，最終獲得滿(mǎn)足條件的抗原。
用原始抗原免疫五只小鼠，并篩選陽(yáng)性血清。
為了篩選到符合要求的抗體，我們將綠色熒光蛋白GFP與抗原蛋白在哺乳動(dòng)物細胞中融合表達，通過(guò)FITC信號將表達GFP的細胞篩選出來(lái)，作為流式分析抗體特異性的陽(yáng)性細胞；并使用能夠識別GFP的一抗作為陽(yáng)性抗體對照，來(lái)篩選特異性抗體。
流式分析檢測結果(GFP抗體和GFP陽(yáng)性細胞百分比)：
流式檢測中對抗原免疫原性最強的為3號小鼠血清，4號次之，我們決定對小鼠3號和4號進(jìn)行融合。
將篩選出的兩只小鼠脾細胞分別進(jìn)行融合、亞克隆，FC檢測保留最佳陽(yáng)性抗體，最終獲得最佳的30株抗腫瘤抗原A候選單克隆抗體雜交瘤細胞株。
看一下我們都做了哪些工作?
a. 對3號小鼠細胞融合后的上清，進(jìn)行ELISA檢測，從中篩選出42株陽(yáng)性細胞株（下表）。
b. 對3號小鼠細胞融合后的上清，進(jìn)行FC檢測，從中篩選出14株陽(yáng)性細胞株（下表）。
c. 生產(chǎn)的抗體，進(jìn)行FC檢測，從中篩選出30株陽(yáng)性細胞株（下表）。
小結
經(jīng)過(guò)多系統表達測試，我們成功地在哺乳動(dòng)物細胞中重組表達了目標抗原，開(kāi)發(fā)出對抗原具有良好親和力和特異性的單克隆抗體。最終，我們生產(chǎn)并純化得到了30株抗腫瘤抗原A抗體的單克隆細胞株，產(chǎn)生的抗體均可以在流式細胞術(shù)中成功識別抗原。
抗腫瘤抗原A雜交瘤測序獲得鼠單抗的VH和VL序列。
做了8個(gè)嵌合抗體的表達純化，將8個(gè)嵌合抗體和1個(gè)原始雜交瘤細胞純化得到的抗體進(jìn)行ELISA驗證，用Biacore檢測了這9個(gè)抗體的親和力，篩選到了高親和力的嵌合抗體。
表達了18個(gè)人源化抗體，將18個(gè)人源化抗體、原始雜交瘤細胞純化得到的抗體及篩選得到的最佳嵌合抗體，進(jìn)行ELISA驗證，用Biacore檢測了這20個(gè)抗體的親和力，篩選得到高親和力抗體。
接下來(lái)，是最關(guān)鍵的一步。別眨眼哦！
目標：抗腫瘤抗原A和CD3的雙特異性抗體
我們已獲得3個(gè)抗腫瘤抗原A抗體，1個(gè)抗CD3抗體。
AB1（前期項目中開(kāi)發(fā)并測序的小鼠雜交瘤單克隆抗體）
AB2和AB3（通過(guò)噬菌體展示開(kāi)發(fā)的人源單克隆抗體）
AB4 （AB4h）是在專(zhuān)利中公開(kāi)的的抗CD3人源化抗體
我們的抗體設計專(zhuān)家設計了3種類(lèi)型的雙特異性抗體，即CrossMAb，IgG-like format using DuoBodies，and IgG-like bivalent Fab-Fab-Fc format。
將cDNA序列亞克隆到AtaGenix特有的哺乳動(dòng)物細胞表達載體pTXs1中，本項目共使用21個(gè)表達質(zhì)粒（下表）：
總共16種抗腫瘤抗原A和抗CD3的重組抗體片段用于測試。
表達測試結果如下：
CrossMAbs類(lèi)型重組抗體表達純化測試
結果表明，CrossMAbs是表達的，但沒(méi)有以完整的雙特異性抗體結構組裝，處于半形成狀態(tài)。
DuoBodies類(lèi)型重組抗體表達純化測試
No.7: AB1重組抗體；No.8: AB2重組抗體；No.9: AB3重組抗體；No./10: AB4重組抗體
Bivalent Fab-Fab類(lèi)型重組抗體表達純化測試
重組抗體QC結果（還原膠和非還原膠）
結果顯示，對于DuoBodies和Bivalent Fab-Fab抗體類(lèi)型，正確地產(chǎn)生了完整的雙特異性抗體結構。
值得一提的是，我們整個(gè)表達純化過(guò)程對內毒素進(jìn)行了有效的控制和去除，將內毒素控制在<0.1EU/mg。
上面獲得的DuoBodies類(lèi)型重組抗體，目前只能特異識別單一抗體，如何將兩種抗體組合連接，就需要神奇的Fab臂交換技術(shù)。
通過(guò)特定的條件，進(jìn)行Fab臂交換重組抗腫瘤抗原A抗體和抗CD3抗體，形成雙特異性抗體。
對交換重組的雙特異性抗體進(jìn)行檢測：
重組DuoBodies抗體QC結果（還原膠和非還原膠）
1：No.7+No./10；2：No.8+No./10；3：No.9+No./10
重組DuoBodies抗體產(chǎn)量及純度
5.1）SEC-HPLC Analysis
SEC-HPLC檢測結果表明，No.7+No./10重組雙特異性抗體濃度最高，是由兩個(gè)重鏈和兩個(gè)輕鏈組成的理想雜合四聚體。No.8+No./10重組抗體有一些降解或未組裝完全，No.9+No./10重組抗體顯著(zhù)降解或組裝較少。
5.2）ELISA滴定
ELISA滴定法同時(shí)測定雙特異性抗體和以前獲得的親本抗體(AB1、AB2和AB3)對腫瘤抗原A和CD3的結合能力。
針對腫瘤抗原A結合檢測
針對CD3結合檢測
檢測結果顯示，所有陽(yáng)性對照與預期一致。
DuoBodies和Bivalent Fab-Fab抗體與腫瘤抗原A和CD3結合良好，說(shuō)明這兩類(lèi)重組雙特異性抗體構建正確。雖然CrossMAbs類(lèi)型抗體也會(huì )結合，但它們的結合很可能是由半合成狀態(tài)的抗體造成的。
項目的順利推動(dòng)，其中包含2000多封郵件溝通，30多個(gè)技術(shù)人員辛勤實(shí)驗，歷時(shí)4年，中法科學(xué)家通力合作。
目前，其中一個(gè)雙特異性抗體已經(jīng)完成開(kāi)發(fā)，生產(chǎn)并交付客戶(hù)1.237g抗體。接下來(lái)，客戶(hù)計劃采用我們擁有自主知識產(chǎn)權的細胞株進(jìn)行穩定細胞株構建，后續事宜正在商定中。
