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| 種類(lèi) | 研究對象 | 結合技術(shù) |
|---|---|---|
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染色質(zhì)免疫沉淀 (CHIP) |
DNA-蛋白質(zhì) | PCR |
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蛋白質(zhì)免疫沉淀 (PIP) |
抗原-抗體 | 蛋白免疫印跡 |
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放射免疫沉淀 (RIP) |
抗原-抗體 | 放射性同位素技術(shù) |
當然，再結合其他技術(shù)還可以衍生出更多的技術(shù)，本篇先來(lái)剖析一下染色質(zhì)免疫沉淀（CHIP）。
染色質(zhì)免疫沉淀 (ChIP) 是研究體內DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。其原理是在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復合物，并將其隨機切斷為一定長(cháng)度范圍內的染色質(zhì)小片段，然后通過(guò)免疫學(xué)方法沉淀此復合體，特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段。后期通過(guò)對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。
應用：ChIP可以用來(lái)檢測體內反式作用因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用，還可以用來(lái)研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達的關(guān)系。而且，ChIP與其他方法的結合擴大了其應用范圍：ChIP與基因芯片相結合建立的ChIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；ChIP與體內足跡法相結合，用于尋找反式因子的體內結合位點(diǎn)；RNA-ChIP用于研究RNA在基因表達調控中的作用。
甲醛處理細胞
收集細胞，超聲破碎
加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復合物相互結合
加入ProteinA，結合抗體-靶蛋白-DNA復合物，沉淀
對沉淀下來(lái)的復合物進(jìn)行清洗，除去一些非特異性結合
洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復合物
解交聯(lián)，純化富集的DNA-片斷
PCR或基因芯片分析
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翹首以待實(shí)驗成果
然后有人歡喜有人憂(yōu)
怎么把“驚嚇”變成“驚喜”
this is a question
只要找到破解方法，
所有的問(wèn)題都不是問(wèn)題！
今天我們就來(lái)一一擊破
免疫沉淀系列實(shí)驗中那些揪心的問(wèn)題。
| 原因 | 方案 |
|---|---|
| 洗滌不充分 | 離心前蓋上管蓋反復顛倒幾次 |
| 抗體濃度太高 | 檢查推薦抗體用量，嘗試使用更少的抗體 |
| 抗體特異性不夠 | 使用親和純化的抗體，最好預先吸收 |
| 封閉不充分 | 優(yōu)化封閉時(shí)間/溫度，室溫封閉1小時(shí)或4℃封閉過(guò)夜 |
| 封閉液中與其他蛋白發(fā)生抗體的交叉反應 | 換一種不同的封閉液；不要用含抗生素蛋白的牛奶封閉，牛奶含生物素 |
| 操作設備被污染 | 保證電泳儀器、印跡儀器和孵育用容器清潔，無(wú)外源污染物 |
| 原因 | 方案 |
|---|---|
| 蛋白未轉到膜上 | 可以用麗春紅染膜并結合染膠（考馬斯亮藍）后確定條帶是否轉至膜上或轉移過(guò)頭；適當調整轉膜的時(shí)間和電流 |
| 一抗、二抗等不匹配 | 選擇針對一抗來(lái)源的種屬抗體 |
| 過(guò)度封閉 | 使用含0.5%脫脂奶粉或無(wú)脫脂奶的抗體稀釋液；試用不同的封閉液；減少封閉時(shí)間 |
| 洗膜過(guò)度 | 洗膜時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)，加入的去垢劑不宜過(guò)強或過(guò)多，建議使用0.05%的弱去垢劑Tween-20 |
| 曝光時(shí)間太短 | 延長(cháng)膠片的曝光時(shí)間，超感應化學(xué)發(fā)光底物會(huì )持續發(fā)光至少6個(gè)小時(shí) |
| 原因 | 方案 |
|---|---|
| 細胞傳代次數過(guò)多，蛋白表達模式分化 | 使用原始或傳代少的細胞株或進(jìn)行平行實(shí)驗 |
| 樣本處理過(guò)程中目的蛋白發(fā)生降解 |
使用新鮮制備的標本并使用蛋白酶抑制劑；樣本處理時(shí)在冰上操作 |
| 一抗不純 | 使用單克隆或親和純化的抗體，減少非特異條帶 |
| 一抗特異性不高 | 重新選擇或制備高特異性的抗體 |
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