一文搞定CHO穩轉細胞株構建

隨著(zhù)生物技術(shù)的迅猛發(fā)展,全球化資源整合為生物制藥行業(yè)提供了越來(lái)越全面的技術(shù)支撐,抗體藥物的發(fā)展也獲得越來(lái)越多的重視?？贵w藥物開(kāi)發(fā)是一個(gè)非常繁雜的過(guò)程,而穩定細胞株適用于抗體藥開(kāi)發(fā)的各個(gè)階段,如重組蛋白和抗體生產(chǎn)、檢測分析、功能性研究等等。構建適用于工業(yè)生產(chǎn)的高表達細胞株是第一步也是關(guān)鍵步驟之一。

普健生物在重組蛋白表達、抗體生產(chǎn)及穩轉細胞株構建等方面有著(zhù)10余年經(jīng)驗。今天小普與大家分享一種基于CHO細胞株構建的高效抗體藥開(kāi)發(fā)策略,能顯著(zhù)提高細胞株開(kāi)發(fā)效率,實(shí)現高效、穩定的細胞株開(kāi)發(fā)。

哺乳動(dòng)物細胞是用于生產(chǎn)單抗在內的商業(yè)化治療性蛋白產(chǎn)品的主要宿主細胞。中國倉鼠卵巢(CHO)細胞是生產(chǎn)蛋白類(lèi)藥物的首選宿主細胞,因為與其他系統相比,CHO細胞具有以下優(yōu)點(diǎn)：

①CHO 細胞對蛋白有準確的加工、修飾功能,因此其表達的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性更接近于天然蛋白；

②CHO 細胞耐受剪切力和滲透壓的能力相對較強,可根據培養要求選擇貼壁培養或懸浮培養的方式；

③整合外源基因后的細胞穩定,重組基因能高效擴增和表達；

④表達目的蛋白可由細胞內運輸到細胞外,并且CHO 細胞只表達少量的內源蛋白,有利于目的蛋白的提取。

哺乳動(dòng)物細胞的培養生長(cháng)過(guò)程需要谷氨酰胺（L-glutamine），谷氨酰胺合成酶（GS)將谷氨酸和氨轉化為谷氨酰胺，哺乳動(dòng)物細胞通過(guò)這一酶促反應獲得谷氨酰胺。

CHO細胞內源的谷氨酰胺合成酶活性比較低,需要在培養基中額外添加外源谷氨酰胺才能促進(jìn)細胞生長(cháng)。利用GS抑制劑,L-氨基亞砜蛋氨酸(Methionine Sulphoximine，MSX)抑制內源性GS活性，用含目的基因和GS基因標記的表達載體,轉染宿主CHO細胞,通過(guò)MSX加壓篩選，促使GS基因和目的蛋白基因擴增,只有轉染了額外GS基因的細胞才可以在不含有谷氨酰胺（L-glutamine）的培養基中生長(cháng),從而篩選獲得重組表達細胞株。

工業(yè)上主要使用兩大類(lèi)CHO細胞：

①GS野生型,含弱的GS活性(GS WT):CHO-K1(ATCC CCL-61,ECACC 85051005)，CHOK1SV(lonza);

②GS缺陷型,敲除GS活性(GS KO):CHOK1SV-KO(Lonza),CHOZN(Merk),HD-BIOP3(Horizon)。

細胞轉染是將外源分子(如DNA,RNA)導入真核細胞，細胞株篩選方案包括一系列步驟：

構建生產(chǎn)重組抗體的CHO穩定細胞株。

Fig.1 單克隆產(chǎn)量分析

Fig.2 流加表達測試產(chǎn)量?jì)?yōu)化

Fig.3 抗體聚體分析（SEC-HPLC）

Fig.4 抗體親和力分析（Biacore）

Fig.5 細胞株穩定性分析圖

XtenCHO^TM高密度表達系統的轉染試劑、表達培養基和補料培養基相較于常用的陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉染試劑、商業(yè)化CHO培養基以及補料培養基,成本大大降低,更適用于工業(yè)生產(chǎn),在規模較大的重組蛋白瞬時(shí)表達生產(chǎn)中更能體現其性?xún)r(jià)比高的特點(diǎn)。

普健生物擁有高效的CHO穩定細胞株構建體系，從上游的雜交瘤抗體測序，到序列優(yōu)化，人源化，再到細胞株構建，個(gè)性化細胞株優(yōu)化及質(zhì)控檢測，整個(gè)技術(shù)體系成熟，儀器配備齊全，能夠快速助力抗體藥的臨床前研究。普健生物憑借十余年的抗體藥物研發(fā)項目經(jīng)驗，自主開(kāi)發(fā)了CHO-GS KO細胞系及GS載體系統，抗體表達產(chǎn)量>3g/L以上。自主研發(fā)了CHO細胞專(zhuān)利轉染技術(shù)，及提高抗體產(chǎn)量的穩定細胞株篩選技術(shù)。擁有完善的抗體質(zhì)量分析平臺，可以提供ELISA、FACS、還原/非還原SDS-PAGE、SDS-CE、SEC-HPLC、LC-MS、ADCC和Biacore等分析。