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蛋白表達問(wèn)題一直備受關(guān)注，如何實(shí)現蛋白高效表達這個(gè)老生常談的話(huà)題，今天還是要跟你們探討一下。
影響蛋白表達的因素主要有：
這個(gè)是很多克隆新人常犯的錯誤，在克隆時(shí)弄錯讀碼框，從而導致蛋白不表達。蛋白表達載體構建正確是蛋白表達實(shí)驗的基礎，構建載體時(shí)要考慮啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)、終止子、融合標簽、復制子等多種因素。
不同宿主菌的基因型不同，選擇合適的宿主菌對某些特殊的載體進(jìn)行蛋白表達至關(guān)重要。有時(shí)表達重組的毒素蛋白，對宿主細胞也有毒性，會(huì )造成質(zhì)粒丟失。
不同物種間基因組的GC含量有顯著(zhù)差異，GC含量通常間接對基因表達進(jìn)行調控和影響，超過(guò)70%可能會(huì )減低蛋白表達水平。
（1）密碼子偏愛(ài)性
不同物種的基因在密碼子使用上存在著(zhù)明顯的偏愛(ài)性，甚至同物種內不同功能的基因其密碼子使用頻率也存在較大的差異，密碼子偏愛(ài)性對重組蛋白的表達具有深刻復雜的影響。
密碼子的偏愛(ài)性是通過(guò)控制可用tRNA豐度影響蛋白的翻譯過(guò)程，tRNA的缺乏可能導致對應的稀有密碼子在蛋白表達過(guò)程中使翻譯速率降低甚至終止，從而使蛋白水平顯著(zhù)降低。
（2）密碼子的使用頻率低。
某些基因本身含稀有密碼子，擁有所用宿主的稀有密碼子越多的基因，越難在該宿主中表達出理想水平的重組蛋白?？蛇x用高頻使用的密碼子替代基因中存在的已選宿主的稀有密碼子，或在排除原始基因中的稀有密碼子的基礎上進(jìn)行重新合成，同時(shí)使密碼子組成頻率更接近宿主。
但是研究表明，密碼子的優(yōu)化必須與蛋白的高級結構聯(lián)系起來(lái)，如果通過(guò)一味地替換稀有密碼子來(lái)提高重組蛋白的表達可能會(huì )起到適得其反的結果。
mRNA如果形成大而穩定的二級結構如發(fā)卡結構和莖環(huán)結構，尤其是起始密碼子附近的穩定二級結構，將會(huì )影響mRNA在翻譯過(guò)程中核糖體的結合和延伸，從而降低翻譯的效率和最終的蛋白表達水平。
如果序列里有和核糖體結合位點(diǎn)/或翻譯起始位點(diǎn)互補的序列，由此形成的mRNA二級結構，會(huì )讓翻譯嘎然而止，此時(shí)就需要進(jìn)行同義密碼子替換。
因此，合理優(yōu)化翻譯起始區的mRNA二級結構，將有效提高目的蛋白表達水平。
蛋白的表達調控分為轉錄水平和翻譯水平，一般來(lái)說(shuō)，轉錄水平起關(guān)鍵作用，但同時(shí)翻譯的效率與mRNA的降解直接相關(guān)，因此，也間接影響著(zhù)轉錄后水平的調控。原核表達中，存在稀有密碼子的mRNA翻譯過(guò)程受到影響，使得mRNA得不到更多核糖體結合后的有效保護，也將導致mRNA的降解從而使蛋白積累水平顯著(zhù)降低。
堿基的缺失、插入或突變，都會(huì )對翻譯的蛋白產(chǎn)生影響，在PCR擴增時(shí)，堿基序列突變?yōu)榻K止密碼子，會(huì )導致蛋白翻譯意外終止。所以在進(jìn)行表達之前，通常要進(jìn)行測序來(lái)避免這種情況的發(fā)生。
當然，影響蛋白表達的其他要素或優(yōu)化方法，還包括檢查單核苷酸重復和密碼子重復，起始密碼子環(huán)境，終止密碼子及其環(huán)境，避免內含子、AT 富含區、內部核糖體進(jìn)入位點(diǎn) (IRES)、重組位點(diǎn)等不利元件，選擇合適的 UTR 序列和信號肽序列，合理設計酶切位點(diǎn)、接頭、融合基因、檢測和純化標簽等。其他影響蛋白表達因素，歡迎大神補充。
