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生物藥開(kāi)發(fā)是一個(gè)非常復雜的過(guò)程，而構建適用于工業(yè)生產(chǎn)的高表達的細胞株是第一步也是最關(guān)鍵的步驟之一。CHO細胞的GS篩選系統是工業(yè)上用得最廣泛的篩選系統。CHO細胞GS篩選系統主要有以下優(yōu)點(diǎn)：
① CHO細胞遺傳背景清楚，很少分泌內源蛋白，利于外源蛋白的分離純化。
② GS篩選系統產(chǎn)量高，周期快，工業(yè)認證度高。
基于豐富的重組表達抗體生產(chǎn)經(jīng)驗及穩轉細胞株構建經(jīng)驗，小普在這里給大家分享一種高效的抗體藥開(kāi)發(fā)CHO細胞株構建策略。
01
GS篩選系統原理
哺乳細胞的生長(cháng)離不開(kāi)谷氨酰胺，谷氨酰胺合成酶是一種能將谷氨酸和氨合成為谷氨酰胺的酶。這種酶促反應是動(dòng)物細胞獲得谷氨酰胺的途徑。
CHO細胞內源的谷氨酰胺合成酶活性比較低，無(wú)法表達足夠的谷氨酰胺維持細胞快速生長(cháng)，必須在培養基中添加外源的谷氨酰胺。GS抑制劑，L-氨基亞砜蛋氨酸（Methionine Sulphoximine，MSX），可用于抑制內源性GS活性，用含目的基因和GS基因標記的表達載體，轉染宿主CHO細胞，通過(guò)MSX加壓篩選，促使GS基因和目的蛋白基因擴增，只有轉染了額外GS基因的細胞才可以在不含有L-glutamine的培養基中生長(cháng)，從而篩選獲得重組表達細胞株。
02
篩選策略
2.1 宿主細胞選擇
工業(yè)上主要使用兩大類(lèi)CHO 細胞：① GS野生型，含弱的GS活性（GS WT）：CHO-K1（ATCC CCL-61，ECACC 85051005），CHOK1SV（lonza)；② GS缺陷型，敲除GS活性（GS KO）：CHOK1SV-KO（Lonza),CHOZN（Merk）,HD-BIOP3(Horizon)。
使用這些商業(yè)化的細胞株，需要支付高額的專(zhuān)利費用。普健生物憑借近十年的抗體藥物研發(fā)項目經(jīng)驗，自主開(kāi)發(fā)了CHO-GS KO細胞系及GS載體系統，經(jīng)過(guò)大量的重組表達項目驗證，產(chǎn)量高達3g/L以上，穩定性好。
2.2 細胞株篩選方案
① 重組載體構建。選擇適合的信號肽，對抗體重輕鏈基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化。將目的基因構建到普健專(zhuān)有的GS載體上。
② 轉染及Minipools篩選。使用普健生物專(zhuān)利（2019111820312、201910992950X、202111448761x、202211173542X）的CHO細胞轉染方法進(jìn)行轉染。轉染48h后，加壓篩選Minipools。利用Elisa 或Octet進(jìn)行初篩，選取最優(yōu)的30個(gè)minipools，逐級擴大培養至TPP搖管中，利用簡(jiǎn)單的流加表達工藝篩選出3株最優(yōu)的minipools。
③ 細胞株單克隆化。采用特定的有限稀釋方法鋪板，Imager跟蹤成像。利用Elisa或Octet進(jìn)行初篩，選取最優(yōu)的30個(gè)monoclones，逐級擴大培養至TPP搖管中，利用簡(jiǎn)單的流加表達工藝篩選出10株最優(yōu)的monoclones。將10株最優(yōu)的monoclones傳至搖瓶中，利用特定的搖瓶工藝對10株monoclones 進(jìn)行細胞生長(cháng)特性，代謝特性，產(chǎn)量，抗體糖基化修飾，抗體聚體等質(zhì)量分析，綜合篩選出最優(yōu)的3株生產(chǎn)用細胞株。
④ 個(gè)性化產(chǎn)量?jì)?yōu)化和糖型調節。普健生物有多種基礎培養基，補料培養基及流加表達培養方案?？梢愿鶕煌募毎晟L(cháng)特性， 篩選出最優(yōu)的流加表達工藝。同時(shí)，也可以用特定的調糖培養基調節不同的糖型的比例。
⑤ 完善的抗體質(zhì)量評估系統。主要包括抗體效價(jià)，活性分析；抗體聚體分析；抗體糖基化分析；抗體效能分析等。
⑥ 生產(chǎn)細胞株穩定性分析。包括基因型穩定性分析及30個(gè)代次的傳代穩定性分析。
03
案例展示
圖1 單克隆產(chǎn)量分析
圖2 流加表達測試產(chǎn)量?jì)?yōu)化
圖3 抗體聚體分析（SEC-HPLC）
圖4 抗體親和力分析（Biocore）
圖5 細胞株穩定性分析圖
04
穩定細胞株構建服務(wù)
高效的CHO穩定細胞株構建體系，需要從上游的雜交瘤抗體測序，到序列優(yōu)化，人源化，再到細胞株構建，個(gè)性化細胞株優(yōu)化及質(zhì)控檢測，整個(gè)技術(shù)體系成熟，儀器配備齊全，能夠快速助力抗體藥的臨床前研究。CHO-GS KO細胞系及GS載體系統，抗體表達產(chǎn)量>3g/L以上。CHO細胞專(zhuān)利轉染技術(shù)，及提高抗體產(chǎn)量的穩定細胞株篩選技術(shù)。完善的抗體質(zhì)量分析平臺，可以提供Elisa、FACS、還原/非還原SDS-PAGE、SDS-CE、SEC-HPLC、LC-MS、ADCC和Biacore等分析。
?優(yōu)勢
高質(zhì)：外源基因嚴格鑒定，細胞來(lái)源清晰，無(wú)污染。
高產(chǎn)：重組蛋白/抗體表達量可快速優(yōu)化至2g/L以上穩定表達。
穩定：獨有的GS穩轉系列載體配合MSX藥物篩選，實(shí)現穩定傳代15-30代以上。
快速：篩選高產(chǎn)細胞株，周期短至3個(gè)月。
靈活定制：可針對重組蛋白/抗體全長(cháng)或片段進(jìn)行個(gè)性化表達。
經(jīng)驗豐富：專(zhuān)業(yè)的技術(shù)團隊，已成功為國內外多家醫藥公司和研究單位構建交付穩定細胞株。
多篩選系統：G418/潮霉素/嘌呤霉素篩選系統，GS/DHFR 篩選系統等。
