聯(lián)系我們
CHO細胞作為細胞界的高富帥，早在8年前它就已經(jīng)身價(jià)超過(guò)了500億美金。大部分成功人士的背后都藏有一部血淚史，它們也不例外。
Long long ago，它們也只是一種名叫中國倉鼠的物種身上默默無(wú)聞的卵巢細胞。
So,diao絲是如何開(kāi)啟逆襲之路的呢？
讓我們將時(shí)間撥回到1919年，北京協(xié)和醫院的E.T. Hsieh博士在肺炎球菌感染研究時(shí)，一時(shí)找不到實(shí)驗室專(zhuān)用小鼠，于是派人去京郊把遍地都是的中國倉鼠逮了不少回來(lái)用于實(shí)驗。那時(shí)誰(shuí)也不曾想到就是這么一個(gè)現在看來(lái)很神奇的操作，將把中國倉鼠們帶上了一條被馴化成為實(shí)驗動(dòng)物的“不歸路”。我們也不知道當年那群在京郊晃悠的倉鼠們回憶至此會(huì )不會(huì )后悔沒(méi)有好好規劃行動(dòng)路線(xiàn)，嚶嚶嚶......
1924年，又是兩名在協(xié)和工作的研究人員，Jocelyn Smyly和Charles Young發(fā)現中國倉鼠很容易感染寄生蟲(chóng)利什曼原蟲(chóng)從而引發(fā)Black fever黑熱病，至此中國倉鼠寶寶們“淪”為科研人員研究各種傳染性疾病的有力工具。
隨著(zhù)時(shí)間的推移中國倉鼠在醫學(xué)界的作用有目共睹。1928年，還是協(xié)和醫學(xué)院，有個(gè)叫Marshall Hertig的研究人員將150只中國倉鼠帶到了哈佛醫學(xué)院，希望將其建成一個(gè)品系，結果。。。結果他沒(méi)成功。
一直到了1943年，現代遺傳學(xué)先驅Guido Pontecorvo（對，就是那個(gè)發(fā)現真菌準確周期的Ponte）在低倍顯微鏡下觀(guān)察中國倉鼠的染色體，發(fā)現只有14條（實(shí)際為2n=22），比起其它常用的實(shí)驗鼠（小鼠的40條、大鼠的42條）要少，這使得中國倉鼠又多了一項送命奉獻業(yè)務(wù)--用于染色體的研究。
轉眼到了1948年12月，某個(gè)冬日黑暗的深夜，正在中國參加洛克菲勒基金會(huì )研究亞洲瘧疾醫學(xué)計劃的Dr.Robert Briggs Watson受美國北部最大實(shí)驗動(dòng)物供應商Victor Schwentker囑托，帶著(zhù)20只由胡正祥教授贈予的中國倉鼠，穿過(guò)紛飛的戰火歷經(jīng)千辛萬(wàn)苦運至美國舊金山，最后又轉輾轉到紐約成功交到Victor Schwentker手中。
大難不死，必有后福，經(jīng)過(guò)Victor Schwentker兩年的專(zhuān)門(mén)馴養，中國倉鼠終于被馴化成一種實(shí)驗室動(dòng)物品系。這其中還有一個(gè)小插曲，哈佛大學(xué)的George Yerganian用更好的顯微鏡發(fā)現中國倉鼠有22條染色體，不是此前Pontecorvo報道的14條，即便如此小倉鼠們也擁有用于染色體研究的絕對優(yōu)勢。
Yerganian在長(cháng)時(shí)間飼養中國倉鼠過(guò)程中，針對其特性摸索出一套專(zhuān)門(mén)的飼養方法，并將此套方法公開(kāi)。不過(guò)也許是因為這些小倉鼠們水土不服吃不慣“西餐”，也許是因為上述飼養方法不一定適用于所有中國倉鼠族群。很長(cháng)一段時(shí)間內，Yerganian成為了此品系在美唯一供應商，單一供應限制中國倉鼠大面積應用。
命運的齒輪轉到1957年，University of Colorado Medical Center的Dr.Theodore T. Puck和其同事Fa-Ten Kao在波士頓癌癥研究中心得到一只雌性中國倉鼠（你們絕對想不到這只倉鼠是被一名中年婦女放在提籃里，乘坐2天火車(chē)抵達實(shí)驗室的，是不是很妙的操作），并成功分離我們熟知的CHO-K1細胞系，由于該細胞快速懸浮生長(cháng)和高蛋白表達的特性，CHO細胞開(kāi)始在科研和企業(yè)獲得普遍的應用。
1983年，Dr.Theodore T. Puck成立Cytogen Research and Development, Inc.公司，無(wú)償為研究機構提供中國倉鼠。
1984年，Genentech公司首次實(shí)現重組中國倉鼠卵巢細胞表達組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)并于1987年成功獲批上市，這是哺乳動(dòng)物細胞表達系統生產(chǎn)蛋白藥物的一個(gè)標志性事件。
隨后，許多外源蛋白基因相繼被轉染到哺乳動(dòng)物細胞，一些有價(jià)值的蛋白不斷實(shí)現表達，包括凝血因子（coagulation factors）、促紅細胞生成素(EPO)、免疫球蛋白（immune globulin）、尿激酶(urokinase)、乙肝表面抗原（HBsAg）和單克隆抗體等，極大地促進(jìn)了生物藥工業(yè)的發(fā)展。
同時(shí)，隨著(zhù)CHO細胞在實(shí)驗室的普及，科學(xué)家成功分離出不同亞型的CHO細胞株，比如CHO-S, , CHO DXB11, CHO DG44， CHO-M以及近年來(lái)受到持續關(guān)注的GS基因敲除CHO細胞（如Merck/Sigma Aldrich公司的CHOZN, Lonza的CHO GS Xceed, Horizon公司用rAAV技術(shù)敲除的CHO細胞）。
在與科研人員多年相愛(ài)相殺中，CHO也終于走向“鼠”生巔峰。
目前，中國倉鼠卵巢（CHO）細胞是生產(chǎn)蛋白類(lèi)藥物的首選宿主細胞，因為與其他系統相比，CHO細胞具有以下優(yōu)點(diǎn)：①CHO 細胞對蛋白有準確的加工、修飾功能，因此其表達的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性更接近于天然蛋白；②CHO 細胞耐受剪切力和滲透壓的能力相對較強，可根據培養要求選擇可貼壁培養或懸浮培養的方式；③整合外源基因后的細胞穩定，重組基因能高效擴增和表達；④表達的目的蛋白可由細胞內運輸到細胞外，并且CHO 細胞只表達少量的內源蛋白，有利于目的蛋白的提取。
至今為止，FDA（美國食品藥品管理局）和EMA（歐洲藥品管理局）已經(jīng)批準超過(guò)70種治療性mAbs，其中39種是由CHO細胞生產(chǎn)（見(jiàn)表1），除此之外，還有幾百種mAbs處于臨床階段。
普健生物的XtenCHOTM 高密度瞬轉表達系統
簡(jiǎn)介：XtenCHOTM 高密度瞬轉表達系統是Atagenix 基于CHO-K1自主開(kāi)發(fā)的一套高效表達蛋白和抗體的瞬時(shí)表達系統，該系統不僅表達量高（一般為200-400mg/L，部分抗體的表達量高達1g/L），而且工藝簡(jiǎn)單，既適用人源化抗體小體積高通量篩選，又適用于大體積的放大生產(chǎn)。
重組蛋白在抗原制備、蛋白相互作用、酶學(xué)分析、藥物靶標研究等方面應用廣泛，選擇合適的重組蛋白表達方法對于能否及時(shí)獲得所需數量和質(zhì)量的重組蛋白至關(guān)重要。常規的重組蛋白表達系統我們并不陌生，主要有原核表達系統、哺乳動(dòng)物細胞表達系統、酵母表達系統、枯草芽孢桿菌表達系統、昆蟲(chóng)桿狀病毒表達系統，各有優(yōu)缺點(diǎn)，其中哺乳動(dòng)物細胞表達系統因其表達的蛋白更接近天然狀態(tài)，且最容易保留生物活性，而備受關(guān)注，但表達量通常是一大難題。
臨床及實(shí)驗室研究中，經(jīng)常要求在短時(shí)間內生產(chǎn)一定量的重組蛋白。穩定表達細胞株生產(chǎn)重組蛋白過(guò)程繁瑣且周期長(cháng)；瞬時(shí)基因表達技術(shù)則能在短期內高表達重組蛋白，因而得到廣泛應用。隨著(zhù)生物醫藥研究技術(shù)的發(fā)展，快速生產(chǎn)毫克到克級別的重組蛋白瞬時(shí)表達體系被廣泛用于新藥篩選和臨床前研究。
1 XtenCHOTM 高密度瞬轉表達系統簡(jiǎn)介
XtenCHOTM 高密度瞬轉表達系統是Atagenix 自主開(kāi)發(fā)的一套高效表達蛋白和抗體的瞬時(shí)表達系統，主要包括以下組分：
① XtenCHOTM cell line；② ATGfect solution；③ Basic expression medium/ATGfeed medium。該系統不僅表達量高（一般為200-400mg/L，部分抗體的表達量高達1g/L），而且工藝簡(jiǎn)單，既適用人源化抗體小體積高通量篩選，又適用于大體積的放大生產(chǎn)。
2 XtenCHOTM 高密度瞬轉表達系統優(yōu)勢
① XtenCHOTM 細胞是Atagenix 開(kāi)發(fā)的一種經(jīng)基因改造的重組CHO細胞株，使用含配套元件的載體，可以使轉染進(jìn)入細胞的表達載體拷貝數增加，延長(cháng)游離質(zhì)粒在細胞內的停留時(shí)間，從而使載體攜帶的目的基因獲得高水平，持續表達。
② XtenCHOTM 高密度瞬轉表達系統改進(jìn)了CHO常規轉染方法，采用新穎的高密度轉染方法和特殊的細胞培養模式，提高了轉染后的細胞活率，使轉染細胞存活時(shí)間從常規6-7天延長(cháng)至10-14天，進(jìn)一步提高了目的蛋白的產(chǎn)量。
③ XtenCHOTM 高密度瞬轉表達系統的轉染試劑、表達培養基和補料培養基相較于常用的陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉染試劑、商業(yè)化CHO 瞬轉培養基以及補料培養基，成本大大降低，更適用于工業(yè)生產(chǎn)，在規模較大的重組蛋白瞬時(shí)表達生產(chǎn)中更能體現其性?xún)r(jià)比高的特點(diǎn)。
3 XtenCHOTM 高密度瞬轉表達系統測試結果
3.1 與其它商業(yè)化表達系統的比較
使用XtenCHOTM 高密度瞬轉表達系統和其它公司的兩個(gè)商業(yè)化CHO 瞬轉表達系統CHO Expression system 1 和 CHO Expression system 2 同時(shí)對一個(gè)抗體進(jìn)行表達，轉染后的細胞密度和活率監測及抗體產(chǎn)量見(jiàn)圖1和圖2：
圖1 不同表達系統轉染后細胞密度活率監測
圖2 不同表達系統表達相同抗體產(chǎn)量比較
3.2 不同治療性重組抗體表達測試
選取4種典型的治療性重組抗體序列，用XtenCHOTM 高密度瞬轉表達系統進(jìn)行表達測試?？贵w產(chǎn)量見(jiàn)圖3：
圖3 XtenCHOTM 系統表達不同抗體的產(chǎn)量測定
Ab1: Pembrolizumad, Ab2: Utomilumab, Ab3: PF, Ab4: Claudiximab
普健生物正是應用自有的高密度重組抗體表達系統XtenCHOTM實(shí)現全長(cháng)及多種形式的重組抗體表達，利用自主開(kāi)發(fā)細胞系及轉染細胞系可實(shí)現重組抗體的克級生產(chǎn)。同時(shí)擁有內毒素控制和去除的專(zhuān)一主線(xiàn)，能夠達到制藥級別的內毒控制（<0.1EU/mg），可提供一系列高質(zhì)量藥物對照抗體，供科研工作者選購使用。
|
Specificity Target |
Name |
Catalog |
Species |
identification |
Source |
|
IL-6R |
Tocilizumab ( 托珠單抗 ) |
ATAD00661 |
Humanized |
IgG1 |
CHO cells |
|
ANGPTL3 |
Evinacumab ( 依維蘇單抗 ) |
ATAD00368 |
Homo sapiens |
IgG4-kappa |
CHO cells |
|
C5 |
Eculizumab ( 依庫珠單抗 ) |
ATAD00006 |
Humanized |
IgG2-G4-kappa |
CHO cells |
|
C5 |
Ravulizumab ( 雷夫利珠單抗 ) |
ATAD00472 |
Humanized |
IgG2-G4-kappa |
CHO cells |
|
CALCA /CALCB |
Eptinezumab ( 依普奈珠單抗 ) |
ATAD00452 |
Humanized |
IgG1-kappa |
CHO cells |
|
CD19 |
Tafasitamab |
ATAD00363 |
Humanized |
IgG1-G2-kappa |
CHO cells |
|
CD19 |
Inebilizumab ( 英比利珠單抗 ) |
ATAD00387 |
Humanized |
IgG1-kappa |
CHO cells |
|
CD22 |
Inotuzumab ( 奧英妥珠單抗 ) |
ATAD00166 |
Humanized |
IgG4-kappa |
CHO cells |
|
CD3 |
Teplizumab ( 替利組單抗 ) |
ATAD00665 |
Humanized |
CHO cells |
|
|
CD3E |
Otelixizumab ( 奧昔組單抗 ) |
ATAD00147 |
Chimeric,Humanized |
IgG1-lambda |
CHO cells |
|
CD52 |
Alemtuzumab ( 阿侖珠單抗 ) |
ATAD00001 |
Humanized |
IgG1-kappa |
CHO cells |
|
CTLA4/CD152 |
Tremelimumab ( 曲美木單抗 ) |
ATAD00156 |
Homo sapiens |
IgG2-kappa |
CHO cells |
|
EGFR/ERBB1 |
Necitumumab ( 奈妥木單抗 ) |
ATAD00193 |
Homo sapiens |
IgG1-kappa |
CHO cells |
|
ERBB2 |
Trastuzumab ( 曲妥珠單抗 ) |
ATAD00686 |
Humanized |
Human IgG1 |
CHO cells |
|
ERBB2/EGFR2/CD340 |
Pertuzumab ( 珀妥珠單抗 ) |
ATAD00025 |
Humanized |
IgG1-kappa |
CHO cells |
|
IGF1R/CD221 |
Ganitumab ( 加尼妥單抗 ) |
ATAD00096 |
Homo sapiens |
IgG1-kappa |
CHO cells |
|
IGHE |
Tanezumab ( 他尼組單抗 ) |
ATAD00142 |
Humanized |
IgG1-nd |
CHO cells |
|
IL12B |
Ustekinumab ( 烏司奴單抗 ) |
ATAD00100 |
Homo sapiens |
IgG1-kappa |
CHO cells |
|
IL17A |
Secukinumab ( 司庫奴單抗 ) |
ATAD00222 |
Homo sapiens |
IgG1-kappa |
CHO cells |
|
IL1B |
Canakinumab ( 卡那奴單抗 ) |
ATAD00155 |
Homo sapiens |
IgG1-kappa |
CHO cells |
參考資料：
Rawley JD.Theodore T. Puck (September 24, 1916–November 6, 2005). American Journal HumanGenetics 2006;78(3): 365–366.
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Landauer K, Woischnigg H, Hepp N et al (2011)Development of a chemically defined CHO medium by engineering based on a feed solution.BMC Proc 5(Suppl 8):P41
CHO MEDIA PLATFORM FACILITATES INTEGRATED CELLLINE DEVELOPMENT AND MEDIA OPTIMIZATION, IrvineScientic Poster in ESACT 2017
