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蛋白定量
蛋白定量即蛋白質(zhì)定量，蛋白質(zhì)定量根據其目的分為蛋白質(zhì)的“總定量”和特定蛋白質(zhì)的“個(gè)別定量”。蛋白定量是生物學(xué)實(shí)驗不可缺少的一部分，為驗證細胞裂解是否成功，或為了將多個(gè)樣品進(jìn)行平行實(shí)驗比較或標準化保存，需對細胞裂解液進(jìn)行蛋白定量；為了判定蛋白的產(chǎn)量，需對純化好的蛋白進(jìn)行定量；為了將純化好的蛋白用生物素或報告酶進(jìn)行標記，同樣需要首先對蛋白樣品進(jìn)行定量，以保證標記反應在適當的化學(xué)濃度下進(jìn)行。
蛋白質(zhì)是一種十分重要的生物大分子，它種類(lèi)繁多，結構不一，功能各異，分子量相差很大，因此建立一個(gè)理想而又通用的蛋白質(zhì)定量分析方法很因難。
現測定蛋白質(zhì)含量的方法有很多：根據物理性質(zhì)來(lái)分有紫外分光光度法；根據化學(xué)性質(zhì)來(lái)分有凱氏定氮法、雙縮脲法、Folin-酚試劑法（Lowary法）、BCA法和膠體金法；根據染色性質(zhì)有考馬斯亮藍染色法、銀染法；根據其他性質(zhì)有熒光法；其中較為常見(jiàn)的有以下五種。
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紫外分光光度法
蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸具有吸收紫外光的性質(zhì)，其吸收高峰在280 nm波長(cháng)處，且在此波長(cháng)內吸收峰的光密度值與蛋白濃度成正比，故可作為蛋白質(zhì)定量測定的依據。該方法是最快的蛋白質(zhì)定量方法，但由于各種蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量不同，如要準確定量則應有待測蛋白質(zhì)的純品作為標準來(lái)比較，或者知道其消光系數作為參考。另外，不少雜質(zhì)在280 nm波長(cháng)下也有—定吸收能力，可能發(fā)生干擾，其中核酸(嘌呤和嘧啶)的影響尤為嚴重。核酸的最大吸收峰是在260 nm，因此若溶液中存在核酸，必須同時(shí)測定OD260與OD280，然后根據兩種波長(cháng)的吸收度比值，通過(guò)經(jīng)驗公式校正，以消除核酸的影響而推算出蛋白質(zhì)的真實(shí)含量。
操作簡(jiǎn)便迅速，且不消耗樣品(可以回收)，多用于純化蛋白質(zhì)的微量測定。
（1）當待測的蛋白質(zhì)與標準蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸含量差異較大時(shí)，會(huì )產(chǎn)生—定誤差。
（2）混有核酸時(shí)必須分別測定280 nm和260 nm兩處的OD值，再按公式推算蛋白質(zhì)含量。
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雙縮脲法
雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò )合物，稱(chēng)為雙縮脲反應。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能通過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類(lèi)化合物都有雙縮脲反應。紫色絡(luò )合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，故可用來(lái)測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為1-10 mg蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要有硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。
較快速 ，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。
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考馬斯（Comessie)亮蘭結合法
考馬斯亮蘭結合法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的蛋白質(zhì)定量測定法?？捡R斯亮蘭能與蛋白質(zhì)的疏水區相結合，這種結合具有高敏感性，考馬斯亮蘭G250 的最大光吸收峰在465 nm，當它與蛋白質(zhì)結合形成復合物時(shí)，其最大吸收峰變?yōu)?95 nm。在一定范圍內，考馬斯亮蘭G250-蛋白質(zhì)復合物呈青色。在595 nm下，光密度與蛋白質(zhì)含量呈線(xiàn)性關(guān)系。故可以用于蛋白質(zhì)含量的測定。
（1）操作簡(jiǎn)便、快速；檢測靈敏；重復性好。
（2）顯色迅速，約2分鐘內可完成染料與蛋白質(zhì)的結合，所現顏色至少在1小時(shí)內是穩定的。
（3）與改良Lowary法相比，干擾物質(zhì)較少。
（1）當樣品中存在較大量的SDS、TritonX-100等去垢劑時(shí)，顯色反應會(huì )受到干擾。如樣品緩沖液呈強堿性時(shí)也會(huì )影響顯色，故必須預先處理樣品。
（2）考馬斯亮蘭G250染液不宜久存，以1-2月為宜。
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Lowary蛋白定量法
Lowary法是雙縮脲法和福林酚法的結合與發(fā)展，其原理是：蛋白質(zhì)溶液用堿性銅溶液處理，形成銅-蛋白質(zhì)的絡(luò )合鹽，在加入酚試劑后，除使肽鏈中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等顯色外，還使雙縮脲法中肽鍵、堿性銅的顯色效果更強烈。因此，Lowary法的顯色效果比單獨使用酚試劑強烈3-15倍，為雙縮脲法的100倍。由于肽鍵顯色效果增強，從而減小了因蛋白質(zhì)種類(lèi)引起的偏差。
注意事項
（1）酚試劑只在酸性條件穩定，故當其加到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞前，還原反應即能發(fā)生。
（2）為了保證反應進(jìn)行完全，反應在25～30℃水浴中進(jìn)行，反應30 min后準時(shí)比色。
（3）避免還原物質(zhì)干擾本實(shí)驗。
微克級高靈敏度定量測定，穩定。
（1）受植物體內存在的酚類(lèi)物質(zhì)干擾。
（2）去污劑如TritonX-100，SDS，NP-40的濃度超過(guò)0.2%時(shí)會(huì )影響定量結果。
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BCA法
BCA蛋白定量法需要兩種試劑：
試劑A：稱(chēng)取1 g sodium bicinchoninate，2 g Na2CO3，0.16 g酒石酸鈉，0.4 g NaOH和0.95 g NaHCO3，定容到100 ml，用NaOH將pH調到11.25。
試劑B：將0.4 g CuSO4•5H2O溶于10 ml水中。
工作液：100份試劑A和2份試劑B混合。
測量方法：取25 μl 標準品加入到200 μl BCA工作液中，37℃或60 ℃孵育30 min，檢測562 nm處的吸光度繪制標準曲線(xiàn)。用同樣的方法檢測蛋白樣品的吸光度可算出蛋白樣品的濃度。
（1）靈敏度高，檢測濃度下限達到25 μg/ml，最小檢測蛋白量達到0.5 μg，待測樣品體積為1-20 μl。
（2）操作簡(jiǎn)單，快速，45分鐘內完成測定，比經(jīng)典的Lowary法快4倍且更加方便。
（3）測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的去污劑等化學(xué)物質(zhì)的影響，可以兼容樣品中高達5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20，60，80。
（4）在20-200 μg/ml濃度范圍內有良好的線(xiàn)性關(guān)系。
（5）檢測不同蛋白質(zhì)分子的變異系數遠小于考馬斯亮藍蛋白定量法。
（6）經(jīng)濟實(shí)用，除試管外，測定可在微板孔中進(jìn)行，大大節約樣品和試劑用量。
受螯合劑和略高濃度的還原劑（EDTA小于10 mM，DTT小于1 mM，巰基乙醇低于1mM）的影響。
以上是針對全蛋白質(zhì)的“總定量法”，然而許多實(shí)驗需要對溶液中特定蛋白進(jìn)行定量分析，即針對特定蛋白質(zhì)的“個(gè)別定量”。針對特定蛋白定量常用的方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA），免疫印跡分析法（WB）和質(zhì)譜檢測（MS）。
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ELISA
ELISA是溶液中特定蛋白定量的一種常用方法，通常是在96孔板上進(jìn)行，關(guān)鍵步驟是特定抗原/蛋白的固定。具體來(lái)說(shuō)，ELISA有不同變種。
直接或間接ELISA
特定抗原/蛋白直接吸附到檢測板，封閉未被抗原包被的孔板表面，然后在孔板中加入酶標（直接ELISA）或未酶標（間接ELISA）的第一抗體，在測試孔板中，一抗與抗原/蛋白相結合。對于未酶標的第一抗體，加入酶標的第二抗體與第一抗體結合。最后，加入酶底物（通常是四甲基聯(lián)苯胺TMB或堿性磷酸酶ALP）使溶液發(fā)生顏色變化然后使用分光光度計檢測。顏色變化與蛋白質(zhì)濃度是直接相關(guān)的。
直接ELISA的優(yōu)點(diǎn)是速度快，并且沒(méi)有第二抗體的交叉反應問(wèn)題，但局限是第一抗體的標記可能是費時(shí)和昂貴的。此外，信號放大是最弱的。因此，更常用的是
夾心ELISA
特定抗原/蛋白結合在孔板表面包被的第一抗體（捕獲抗體）和酶標的第二抗體（檢測抗體）之間，第二抗體比較容易買(mǎi)到，但可能會(huì )發(fā)生第二抗體的交叉反應。
任何ELISA測定蛋白質(zhì)濃度的一個(gè)重要環(huán)節都是蛋白質(zhì)標準曲線(xiàn)，通常是連續稀釋已知濃度的蛋白質(zhì)，從而繪制標準曲線(xiàn)。
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WB
WB只能半定量。通過(guò)凝膠電泳把原始或變性的蛋白質(zhì)分開(kāi)，把蛋白質(zhì)轉膜（硝酸纖維素或PVDF），然后使用特定的酶標抗體檢測。最后，加入適當的底物（化學(xué)發(fā)光底物）產(chǎn)生可檢測的信號。雖然WB比ELISA更費時(shí)，但是WB不僅可以對特定的蛋白進(jìn)行定量，而且可以在實(shí)驗中同時(shí)檢測蛋白質(zhì)修飾。
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MS
MS是蛋白質(zhì)定量的新興方法。在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，除了蛋白定性之外，一個(gè)重要的步驟就是對特定的蛋白進(jìn)行定量分析。MS定量蛋白的方法有很多。
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常用的方法是較重的穩定同位素碳（13C）或氮（15N）加入到第一個(gè)樣本（多肽或蛋白質(zhì)），而相應的輕同位素（12C和14N）加入到第二個(gè)樣本（內標），然后混合這兩個(gè)樣本進(jìn)行分析。由于兩個(gè)樣本的質(zhì)量差，用質(zhì)譜分析儀測定的兩個(gè)樣本峰強度的比值就相當于其相對豐度比。
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質(zhì)譜蛋白定量的第二種方法，可以不用標記樣本，即用基質(zhì)輔助激光解吸/電離 - MALDI分析。
使用質(zhì)譜這種通用方法可以在一次實(shí)驗中同時(shí)進(jìn)行定量和定性檢測。但這種方法需要的檢測儀器很昂貴，從而限制了該方法的使用。
總之，雖然測定蛋白質(zhì)含量的方法很多，但還沒(méi)有一個(gè)完美的方法。在選擇測定方法時(shí)，可根據實(shí)驗要求和實(shí)驗室條件決定。
