聯(lián)系我們
穩定細胞株構建的第一個(gè)步驟就是細胞轉染，這項實(shí)驗的原理大家都清楚，但是為什么一上手就會(huì )出現多種問(wèn)題，在實(shí)驗第一步就栽了跟頭呢？
是細胞轉染方法不對頭？還是實(shí)驗過(guò)程中的某個(gè)因素影響了轉染效率？了解本文這11個(gè)注意事項，讓你的細胞轉染實(shí)驗順利通關(guān)！
所謂轉染，是指在真核細胞里導入具有生物功能的核酸并核酸的生物功能。通常選用的轉染方法包括物理介導法（如電穿孔法、顯微注射和基因槍等）、化學(xué)介導法（如磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉染方法、多種陽(yáng)離子物質(zhì)介導法）、生物介導法（如原生質(zhì)體轉染、病毒介導轉染等）。上述方法中，實(shí)驗室最常用的方法當屬是脂質(zhì)體轉染（質(zhì)粒轉染）。
質(zhì)粒轉染操作簡(jiǎn)單，分為瞬時(shí)轉染和穩定轉染。針對不同屬性細胞系，選擇轉讓方式時(shí)要做足功課，千萬(wàn)不要圖方便，否則轉染效率簡(jiǎn)直崩潰。影響轉染效率的因素有很多，比如準備不充分、轉染條件不佳；再比如細胞株本身的特性和活性、細胞污染，轉染的DNA/RNA的質(zhì)量，轉染方法，轉染試劑的選擇等，小編總結了這11個(gè)注意事項，一起來(lái)學(xué)習吧！
01血清條件下的細胞轉染
轉染可以使用血清，前提是DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復合物形成時(shí)不含血清，否則會(huì )降低轉染效率（血清會(huì )影響復合物的形成）。
轉染用的培養液可以含血清也可以不加，如加血清則應在DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復合物形成后加入，轉染培養基中加入血清需要對條件進(jìn)行優(yōu)化。
對于對血清缺乏比較敏感的貼壁細胞，建議使用專(zhuān)用轉染試劑。條件允許情況下，可以用無(wú)血清培養基代替PBS洗細胞兩遍，注意洗的時(shí)候要輕，靠邊緣緩緩加入液體，然后不要吹吸細胞，而是轉動(dòng)培養板讓液體滾動(dòng)在細胞表面。如果洗的太厲害，細胞又損失一部分，加了脂質(zhì)體后，細胞受影響就更大了，死亡細胞會(huì )增多。
02培養基中的抗生素（PS）
抗生素（如青霉素、鏈霉素等）是影響轉染的培養基添加物。由于陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性，使得對真核細胞無(wú)毒的抗生素進(jìn)入細胞，從而降低細胞活性，導致轉染效率降低。因此，應避免在轉染前細胞鋪板時(shí)和在轉染培養基中使用抗生素，在轉染前也不必潤洗細胞。
03細胞狀態(tài)
眾所周知，細胞的生長(cháng)狀態(tài)影響實(shí)驗結果，原代細胞和傳代次數多的細胞都不是最佳選擇，處于對數生長(cháng)期的細胞生長(cháng)狀態(tài)最好，最適合轉染。有文獻研究傳代不要超過(guò)17代，細胞復蘇后的3代左右時(shí)細胞狀態(tài)最好，傳代過(guò)多細胞形態(tài)都會(huì )發(fā)生變化。大多數已建立的細胞系都是非整倍體，原代培養包括了表達不同基因組合的細胞的混合物。細胞培養在實(shí)驗室中保存數月和數年后會(huì )經(jīng)歷突變，總染色體重組或基因調控變化等而演化。這會(huì )導致和轉染相關(guān)的細胞行為的變化。如果隨時(shí)間發(fā)現這種變化，融化一管新鮮的細胞可能會(huì )恢復原先的轉染活性。因此，如果觀(guān)察到轉染效率降低，可以試著(zhù)轉染新鮮培養的細胞以恢復最佳結果。
04細胞鋪板密度
用于轉染的最佳細胞密度根據不同的細胞類(lèi)型或應用而異。因轉染試劑對細胞有毒害作用，細胞太少，容易死。一般轉染時(shí)，貼壁細胞密度為70%-90%，懸浮細胞密度為2-4×106細胞/ml，確保轉染時(shí)細胞沒(méi)有長(cháng)滿(mǎn)或處于靜止期。因為轉染效率對細胞密度很敏感，所以在不同實(shí)驗間保持一個(gè)基本的傳代步驟很重要。鋪板細胞數目的增加可以增加轉染活性和細胞產(chǎn)量。細胞的融合度必須要達到90%才能做。
05啟動(dòng)子的選擇
獲得高轉染活性所需選擇的啟動(dòng)子依賴(lài)于選用的細胞系和要表達的蛋白。CMV啟動(dòng)子在大多數細胞類(lèi)型中可以獲得高表達活性。同其他啟動(dòng)子，如SV40和RSV(勞斯肉瘤病毒)相比，在BHK-21中其活性最高。這三種病毒啟動(dòng)子在T細胞來(lái)源的細胞系，如Jurkat中組成表達水平較低。轉染后在培養基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat細胞中CMV啟動(dòng)子，而單PMA就足以激活KG1和K562(人骨髓瘤白細胞)中的CMV啟動(dòng)子。SV40啟動(dòng)子的表達在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)時(shí)會(huì )提高，因為大T抗原可以刺激染色體外的合成。
06DNA量
高質(zhì)量的DNA對于進(jìn)行高效的轉染至關(guān)重要。轉染的質(zhì)粒一定純度好、濃度高、無(wú)內毒素。濃度不要低于0.35ug/ul。產(chǎn)物表達，48小時(shí)mRNA表達最高；72h蛋白表達最高。
07瞬時(shí)/穩定轉染表達
穩定基因表達符合長(cháng)期生產(chǎn)需求。整個(gè)實(shí)驗操作流程提供長(cháng)期穩定及規?？烧{的蛋白生產(chǎn)。與穩定基因表達相比，瞬時(shí)表達（TGE）主要適用于短期內制備重組蛋白，普健生物的瞬時(shí)表達使用懸浮細胞，能夠完成mL到100L的體積的蛋白表達，一般在10天內即可快速轉染，無(wú)需質(zhì)粒DNA的遺傳性選擇。
08轉染效率監測
基因的瞬時(shí)表達在24-72小時(shí)內就結束了。這種快速的瞬時(shí)表達非常適用于驗證質(zhì)粒表達和監測轉染步驟的效率。
可以使用報告基因來(lái)確定優(yōu)化條件，其表達蛋白易檢測，在目的細胞中不含此蛋白或水平很低。常用的報告基因包括氯霉素乙酰轉移酶（CAT），綠色熒光蛋白（GFP），熒光素酶（Lux或Luc）以及b-半乳糖苷酶（b-gal）?？梢允褂煤?jiǎn)單的非同位素方法檢測b-gal的表達以測定轉染效率和活性。pCMV SPORT- bgal質(zhì)粒包含CMV啟動(dòng)子調控下的LacZ基因，轉染入真核細胞內后可以直接表達bgal。結合簡(jiǎn)單的檢測步驟，可以做為監測轉染條件的一種方便靈敏的方法。
09穩定轉染細胞系的篩選
用載體中所含的選擇標志進(jìn)行篩選是建立穩定轉染細胞系最常用的方法?？股乜剐曰蚩梢耘c目的基因在同一個(gè)質(zhì)粒上，也可以在不同的質(zhì)粒上。如果兩個(gè)不同的質(zhì)粒同時(shí)轉染，兩個(gè)質(zhì)粒都可能整合形成穩定轉化子。對于兩種不同質(zhì)粒的共轉染，帶有目的基因的質(zhì)粒和帶有篩選標記的質(zhì)粒間的比例為3:1或更高以保證抗性克隆帶有轉染的目的基因。
10蛋白表達和培養基的選擇
哺乳動(dòng)物細胞系合成可溶的、翻譯后修飾的蛋白，比細菌，真菌或昆蟲(chóng)細胞中表達的蛋白更有可能有生物活性。穩定轉染的細胞可以合成大量的重組蛋白，而瞬時(shí)轉染細胞可以快速表達，迅速地合成小量蛋白。普健生物使用細胞系包括CHO，HEK293,CHO-S,CHO-K1等常用細胞系。普健生物提供克隆的HEK293，CHO-S，DG44和CHO-K1細胞，來(lái)源于經(jīng)篩選轉染效率更高的亞細胞系。這些細胞也可用于無(wú)血清和限定化學(xué)成分培養基。重組蛋白的大規模生產(chǎn)一般在穩定轉染的懸浮細胞中進(jìn)行。這些細胞易于生長(cháng)到高密度并合成更多蛋白，使用基質(zhì)珠做為固相支持可以使貼壁細胞懸浮生長(cháng)。
11轉染效率的驗證
最有效的驗證方式必須是qPCR驗證。
熒光觀(guān)察，使用病毒轉染，明白自己病毒的情況，是熒光標記（一般是GFP）還是非熒光標記。質(zhì)粒轉染，可以在載體上添加熒光標記，幫助自己通過(guò)熒光觀(guān)察轉染效率。但是熒光并不能完全證明轉染效率，還是通過(guò)核酸驗證最為準確。
