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殘余牛血清白蛋白（BSA）含量檢測是生物制品質(zhì)量控制的一項重要指標，直接關(guān)系到生物制品的使用安全。世界衛生組織及世界各國藥典對殘余BSA含量均有嚴格限定?！吨袊幍洹罚ㄈ浚?020版規定，成品中牛血清白蛋白殘留量不得>50ng/劑。因此，需要利用特異性好，靈敏度高的抗體建立一種簡(jiǎn)便、高效的牛血清白蛋白殘留量檢測方法。
牛血清廣泛使用于生物制品研究、制備過(guò)程中，雖然在生產(chǎn)過(guò)程中經(jīng)純化可以去除制品中大部分BSA,但微量BSA依然存在于生物制劑成品中。在人體中，超過(guò)一定濃度的BSA易引起人的免疫病理反應，引起嚴重的副作用，影響生物制品的安全性。普健生物基于客戶(hù)需求，對BSA有更為嚴苛的控制標準，此前我們基于鼠抗開(kāi)發(fā)平臺開(kāi)發(fā)出靈敏度為0.51ng/ml，可檢測1.56-100ng/mL的BSA檢測試劑盒。能滿(mǎn)足現行藥典規范BSA殘留檢測要求，并有了穩定的客戶(hù)群體。但在后續的產(chǎn)品回訪(fǎng)中，我們的項目經(jīng)理進(jìn)一步了解了客戶(hù)的項目對BSA殘留其實(shí)有更為嚴苛的控制標準，只是苦于市售產(chǎn)品檢測限以及靈敏度未能完全滿(mǎn)足。普健生物技術(shù)團隊深挖客戶(hù)需求，結合普健生物最新推出的XtenTMMab兔單克隆抗體開(kāi)發(fā)技術(shù)，為客戶(hù)提供了一種全新、高效、高靈敏度的BSA檢測解決方案。
本公司利用兔單B細胞抗體開(kāi)發(fā)技術(shù)，從BSA免疫的兔外周血中，分離BSA特異性的單B細胞，通過(guò)PCR 擴增及測序分析， 獲得多個(gè)特異性識別BSA蛋白的抗體。
本方案篩選的兔單抗較傳統方法雜交瘤技術(shù)篩選的抗體及兔多抗的親和力和特異性更高，具有靈敏度高、穩定性強的特點(diǎn)，檢測范圍為0.78-50ng/mL，為開(kāi)發(fā)高靈敏度的BSA殘留檢測試劑盒奠定了堅實(shí)的基礎。
圖1 普健生物XtenTMMab兔單克隆抗體開(kāi)發(fā)流程
利用普健生物開(kāi)發(fā)的快速免疫方法免疫新西蘭大白兔，三免（Day21）血清效價(jià)大于128K，可以進(jìn)行后續單B細胞流式分選。然后將從PBMC中分離篩選到的B細胞進(jìn)行抗原特異性檢測，陽(yáng)性率大于60%。
|
抗原 |
BSA |
|
包被 |
1ug/ml*100ul |
|
2k |
4k |
8k |
16k |
32k |
64k |
128k |
PBS |
效價(jià) |
|
|
三免血清效價(jià) |
4.32 |
3.32 |
3.26 |
2.98 |
2.53 |
1.85 |
1.16 |
0.03 |
>128K |
圖2 BSA兔血清三免（Day21）效價(jià)檢測結果
圖3 單B細胞ELISA檢測部分結果展示
根據單B細胞ELISA檢測結果，挑選12個(gè)克隆進(jìn)行抗體基因測序及分析，12個(gè)克隆測序全部成功。
圖4 抗體可變區基因分析結果
將測序得到的12個(gè)抗體挑選10個(gè)，利用普健生物自主開(kāi)發(fā)的XtenCHO系統進(jìn)行重組表達，純化后得到純度高，親和力好的重組兔單抗。10株重組兔單抗ELISA效價(jià)均大于1:1000000。
圖5 重組兔抗SDS-PAGE檢測結果
圖6 純化后重組兔抗ELISA檢測結果
將10株重組兔單抗進(jìn)行方陣實(shí)驗配對，得到多對靈敏度高的抗體對，優(yōu)選其中一對, 標曲線(xiàn)性范圍0.78-50ng/mL, R2=0.9992。
圖7 BSA抗體對標準曲線(xiàn)
為了了解不同方法制備抗體親和力的差異，我們將BSA的兔單抗與之前自產(chǎn)的用傳統雜交瘤制備的BSA鼠單抗進(jìn)行了親和力的測試。在此，我們利用OPENSPR將鼠單抗、兔單抗和BSA進(jìn)行了親和力檢測，發(fā)現兔單抗的親和力比鼠單抗高1-2個(gè)數量級。
| ka(1/Ms) | kd (1/s) | KD (M) | |
| BSA&兔抗3D5 |
2.21E+05 |
1.90E-05 |
8.61E-11 |
| BSA&兔抗6B7 | 1.39E+05 | 7.49E-06 | 5.38E-11 |
| BSA&鼠抗1 | 2.81E+04 | 1.39E-04 | 4.95E-09 |
| BSA&鼠抗2 | 1.48E+05 | 2.02E-05 | 1.36E-10 |
剩余未分選的B細胞以及篩選陽(yáng)性的其他單B細胞可以?xún)龃?，以便用于后續篩選其他應用需求的抗體。
如果您對我們的單克隆抗體開(kāi)發(fā)技術(shù)服務(wù)感興趣,您可以直接點(diǎn)擊閱讀原文或點(diǎn)擊文字鏈接，實(shí)時(shí)與我們項目經(jīng)理溝通！服務(wù)咨詢(xún)電話(huà)：027-87001869
普健生物依托自主研發(fā)的高通量活性蛋白表達系統，Single B細胞抗體發(fā)現技術(shù)平臺，噬菌體展示抗體庫技術(shù)和雜交瘤抗體開(kāi)發(fā)平臺，抗體表達、抗體人源化和穩定細胞株構建平臺，與各研究機構展開(kāi)技術(shù)服務(wù)項目合作，助力IVD檢測、疫苗生產(chǎn)、重組抗體開(kāi)發(fā)。
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