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單克隆抗體(monoclonal antibody,mAb)是一種通用的高度特異性結合蛋白，長(cháng)期以來(lái)被認為是對抗疾病的“魔彈”，也是臨床和科研等其他生物學(xué)用途的重要工具。然而這些應用只有在實(shí)現離單個(gè)抗體的方法出現后才得以實(shí)現，雜交瘤技術(shù)就是這把將打開(kāi)單抗應用大門(mén)的“金鑰匙”。
雜交瘤技術(shù)是基于特定的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞的融合，分離出針對給定抗原的單抗(MAbs)的常用技術(shù)。雜交瘤技術(shù)的出現徹底改變了傳統的醫學(xué)和研究領(lǐng)域，隨著(zhù)1984年諾貝爾生理學(xué)或醫學(xué)獎進(jìn)一步認可，雜交瘤技術(shù)越來(lái)越成熟的同時(shí)還不斷發(fā)展，隨之出現了噬菌體展示技術(shù)和單一B細胞抗體展示技術(shù)，越來(lái)越多的新技術(shù)應用到這一領(lǐng)域，填補了雜交瘤策略的局限性。
雜交瘤細胞技術(shù)
由Georges Köhler和Cesar Milstein于1975年描述的雜交瘤技術(shù)是基于用所需抗原免疫動(dòng)物，然后將特異性B淋巴細胞與“不朽”骨髓瘤細胞融合。產(chǎn)生的雜交細胞，稱(chēng)為雜交瘤，然后被克隆以獲得穩定的單克隆細胞系。在選擇感興趣的抗體分泌克隆后，將細胞轉移到大規模培養裝置中，以產(chǎn)生所需數量的抗體。
B淋巴細胞-骨髓瘤細胞融合通常通過(guò)使用化合物聚乙二醇(PEG)獲得。然而，這種藥物在一定程度上可能具有細胞毒性，并可能發(fā)生非特異性膜融合。另一種是通過(guò)珍珠鏈法，在電場(chǎng)和激光輻射的幫助下進(jìn)行聚變。在這種情況下，用脈沖激光束照射接觸細胞表面，在細胞膜上形成一個(gè)小穿孔，這增加了促進(jìn)細胞融合的機會(huì )。盡管珍珠鏈方法比PEG介導的策略有優(yōu)勢，但它仍然不能選擇性地控制特定B淋巴細胞與骨髓瘤細胞的融合。
雜交瘤技術(shù)一直處于單克隆抗體產(chǎn)生領(lǐng)域的前沿。目前，超過(guò)90%被批準用于臨床用途的抗體是由該技術(shù)產(chǎn)生的，其中大多數是嵌合或人源化抗體。然而，基于雜交瘤的單克隆抗體產(chǎn)生的特點(diǎn)是篩選過(guò)程長(cháng)，特異性單克隆抗體分泌細胞的次優(yōu)選擇，在早期階段很少可能進(jìn)行單克隆抗體驗證，更不用說(shuō)需要純化抗原靶點(diǎn)的可用性。為了優(yōu)化抗體生成，多年來(lái)已經(jīng)開(kāi)發(fā)了該技術(shù)的幾種變體。
B細胞靶向(BCT)
B細胞靶向(BCT)方法，也稱(chēng)為脈沖電場(chǎng)(PEF)，由Lo等人于1984年描述。它基于兩個(gè)中心點(diǎn):識別感興趣抗原的B淋巴細胞的預選，以及使用直流電脈沖進(jìn)一步將B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合。簡(jiǎn)而言之，特定的生物素標記抗原與相應的B淋巴細胞結合，隨后通過(guò)鏈霉親和素恢復，產(chǎn)生B淋巴細胞-抗原-生物素-鏈霉親和素復合物。然后，將這種B淋巴細胞復合物與生物素標記的骨髓瘤細胞共培養，并將所得到的混合物暴露于PEF以促進(jìn)細胞融合。
最后一步，也是最關(guān)鍵的一步，其特點(diǎn)是靜電場(chǎng)暴露后細胞膜不穩定，這使得細胞間融合的發(fā)生變得容易。
立體特異性靶向(SST)
構象特異性單克隆抗體的早期描述發(fā)表于20世紀60年代，強調了這些抗體特異性識別特定化合物的一種立體異構體的特征。已知立體特異性單克隆抗體對其配體具有高特異性，然而，這些單克隆抗體的產(chǎn)生在技術(shù)上具有挑戰性，特別是在高度結構化和保存良好的靶標的情況下。例如多跨膜蛋白的胞外環(huán)或結構域，如膜結合受體。立體特異性靶向(Stereospecific Targeting, SST)方法就是為了解決這個(gè)問(wèn)題而提出的，SST方法為B淋巴細胞-骨髓瘤細胞融合提供了50%以上的陽(yáng)性，并且發(fā)現超過(guò)24%的生成克隆分泌所需的單克隆抗體。
噬菌體展示技術(shù)
1990年首次報道的噬菌體展示技術(shù)被認為是生成單克隆抗體的有力工具。該方法基于George Smith在1985年描述的噬菌體展示概念，包括開(kāi)發(fā)組合抗體噬菌體文庫——即大量展示抗體片段的噬菌體——以及隨后篩選識別目標抗原的抗體。
噬菌體展示庫的構建是該技術(shù)的重要組成部分?？贵w庫的大小與找到特定抗體的概率成正比關(guān)系。下一代測序(NGS)是分析噬菌體展示文庫的變異性、序列組成和大小的重要工具。構建噬菌體展示文庫比動(dòng)物免疫后產(chǎn)生雜交瘤要昂貴得多。然而，噬菌體展示技術(shù)的抗體篩選步驟更快熟、價(jià)格更優(yōu)。
雖然噬菌體展示文庫是一種前景廣闊的抗體開(kāi)發(fā)技術(shù)，但它也有局限性。噬菌體文庫的多樣性取決于細菌的轉化效率，并且僅限于噬菌體展示文庫中1010-1011變體抗體的最大庫。
單B細胞技術(shù)
以上幾種產(chǎn)生單克隆抗體的技術(shù)平臺的一個(gè)固有特點(diǎn)是需要將B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，長(cháng)期以來(lái)，這是分離已知特異性的單一抗體的必要步驟。
在過(guò)去的幾十年里，技術(shù)的進(jìn)步已經(jīng)允許從異質(zhì)原代細胞群中檢測和分離單一功能的B淋巴細胞，以及抗體基因的擴增和克隆，而無(wú)需使選定的抗體分泌細胞(ASC)永生化。這些單一B淋巴細胞方法，統稱(chēng)為“單個(gè)B細胞技術(shù)”，顯示出快速生成中和單克隆抗體的吸引力和實(shí)用性。
單個(gè)B細胞技術(shù)以單個(gè)B細胞為起始點(diǎn)，利用每個(gè)B細胞只產(chǎn)生一種特異性抗體的特性，直接從單個(gè)B細胞中擴增出抗體基因，進(jìn)而獲得抗原特異性抗體。該技術(shù)所制備的抗體具有高通量、高效率、高穩定性、高特異性等優(yōu)點(diǎn)，保留了豐富的基因多樣性和輕重鏈可變區的天然配對，應用前景廣泛，是最高效的抗體篩選方法之一。事實(shí)上，利用這種技術(shù)獲得了越來(lái)越多的針對病毒病原體感染的單克隆抗體，如HIV、登革熱、MERS-CoV和SARS-Cov-2。
普健生物依托自主研發(fā)的高通量活性蛋白表達系統，Single B細胞抗體發(fā)現技術(shù)平臺，噬菌體展示抗體庫技術(shù)和雜交瘤抗體開(kāi)發(fā)平臺，抗體表達、抗體人源化和穩定細胞株構建平臺，擁有10余年的蛋白、抗體服務(wù)經(jīng)驗及專(zhuān)業(yè)的研發(fā)生產(chǎn)團隊，可提供全面的蛋白表達、抗體制備、抗體藥物發(fā)現、抗體人源化、重組抗體表達等一站式抗體發(fā)現技術(shù)服務(wù)，助力IVD檢測、疫苗生產(chǎn)、重組抗體開(kāi)發(fā)。
自20世紀80年代中期以來(lái)，從雜交瘤技術(shù)的變化開(kāi)始，到噬菌體展示技術(shù)，再到單B細胞技術(shù)的應用，越來(lái)越多的單克隆藥物從理論設計到臨床科研到獲批上市，伴隨著(zhù)人類(lèi)后基因組學(xué)及代謝組學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的單克隆抗體藥物種類(lèi)將會(huì )幫助人們的獲得更多健康和發(fā)展。
