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自1942年首次發(fā)現以來(lái)，免疫熒光染色一直是一種高度可靠和強大的技術(shù)，用于廣泛的研究和診斷目的。
用熒光分子標記的白血病細胞
通常，熒光抗體（FA）技術(shù)將涉及使用細胞或抗體，其恒定區域已用熒光標記標記（也稱(chēng)為熒光團）標記。FA技術(shù)通常分為直接或間接。
直接熒光抗體
直接熒光抗體技術(shù)，也可以稱(chēng)為直接免疫熒光（DIF），涉及使用單個(gè)熒光標記的一抗，用于與靶抗原結合。當臨床使用時(shí)，DIF對于快速診斷細菌性疾病特別有用，如化膿性鏈球菌（通常稱(chēng)為鏈球菌）以及肺炎支原體和嗜肺軍團菌屬引起的肺炎。
出于這種診斷目的，首先將患者樣本放在顯微鏡載玻片上，然后暴露于熒光抗體中。熒光標記抗體和靶抗原（在這些情況下是細菌）之間的任何結合都會(huì )導致這些物質(zhì)在用熒光顯微鏡檢查時(shí)發(fā)光。
除了用作診斷工具外，DIF還廣泛用于科學(xué)研究。為此，將切成5或6微米（μm）薄片的冷凍組織樣品放置在載玻片上。
然后將載玻片與熒光標記抗體一起孵育，熒光標記抗體通常包括一組針對IgA，IgG和IgM抗體同種型的抗體以及針對目標抗原的補體3。
請注意，用于此類(lèi)研究的抗體濃度將基于先前的實(shí)驗，這些實(shí)驗已確認哪種濃度可以達到最高的信噪比。
在載玻片在黑暗和室溫下孵育至少30分鐘后，洗滌載玻片，然后用熒光顯微鏡成像。
間接熒光抗體
與用于DIF的單步技術(shù)相比，間接IF（IIF）或間接FA（IFA）是一個(gè)兩步過(guò)程，首先將未標記的一抗施加到針對靶抗原的樣品上。IIF的第二步涉及使用熒光標記的二抗，該二抗針對一抗的Fc部分。
盡管IIF被認為比DIF更復雜，因為它需要更長(cháng)的時(shí)間才能完成并且需要使用兩種兼容的抗體，但它在靈敏度方面更勝一籌。
IFA測試的一些常見(jiàn)臨床應用包括用于診斷梅毒的測試。對于這種類(lèi)型的IFA測試，先前從研究動(dòng)物中分離出的T. Palladium細胞被分離并放置在載玻片的表面上。然后將從患者獲得的血清散布在鈀錐蟲(chóng)細胞上，以允許抗密螺旋體抗體（如果存在）與固定抗原結合。
沖洗掉患者的血清樣本后，加入用熒光團標記的二抗。梅毒陽(yáng)性結果將照亮所有二抗-熒光團偶聯(lián)物復合物。
另一種廣泛用于臨床環(huán)境的IFA是用于診斷系統性紅斑狼瘡（SLE）的IFA。SLE是一種自身免疫性疾病，其循環(huán)抗核自身抗體（ANA）水平將增加，這些抗體針對DNA和與DNA結合的各種蛋白質(zhì)。
對于這種類(lèi)型的IFA測試，將細胞培養，然后放置在載玻片上。然后將每張載玻片與不同濃度的患者抗體一起孵育，然后洗滌以去除任何未結合的蛋白質(zhì)。在洗滌步驟之后，將熒光標記的二抗（用于ANA測試）添加到載玻片中并使其孵育。然后從顯示熒光的最高血清稀釋度中獲得血清中 ANA 的滴度，并用于確定 SLE 診斷。
流式細胞術(shù)
第三種類(lèi)型的熒光抗體技術(shù)包括流式細胞術(shù)，這是一種自動(dòng)細胞計數系統，可用于定量存在于復雜混合物（如血液或血清）中的特定細胞。
典型的流式細胞術(shù)實(shí)驗將從孵育熒光標記的抗體開(kāi)始，該抗體針對特定的細胞亞群，例如抗CD4，其可以與各種免疫細胞表面發(fā)現的糖蛋白CD4結合，包括T輔助細胞，單核細胞和巨噬細胞。流式細胞術(shù)還可以通過(guò)使用適當的細胞制造商來(lái)量化多種細胞類(lèi)型的存在。
孵育完成后，將樣品引入流式細胞儀。在這臺機器中，狹窄的毛細管迫使樣品中存在的細胞在單個(gè)文件中移動(dòng)。當細胞穿過(guò)毛細管時(shí)，激光用于激活和激發(fā)任何已用熒光團標記的細胞。
然后通過(guò)正向和側向散射檢測器測量每個(gè)激發(fā)細胞的熒光強度，并將其描繪在直方圖上進(jìn)行分析。除了定量目的外，流式細胞術(shù)和免疫熒光都可用于通過(guò)稱(chēng)為熒光激活細胞分選儀（FACS）的技術(shù)將細胞分選為純化的亞群以進(jìn)行研究。
參考文獻
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