納米抗體如何實(shí)現如此高的特異性？

納米抗體如何實(shí)現如此高的特異性？

免疫系統的強大功能在很大程度上取決于抗原的多樣性，這種多樣性促使B淋巴細胞產(chǎn)生特異性的、緊密結合的抗原受體（BCR）。生物學(xué)研究的重要工具——傳統抗體（Abs）以其精湛的結合特異性和對靶抗原的高親和力，成為了生物制藥行業(yè)的基礎。然而，這些抗體的結合特異性的巨大多樣性是由重鏈（VH）和輕鏈（VL）兩個(gè)可變域中的序列變異產(chǎn)生的，如此一來(lái)，僅僅這些序列的排列組合就可能在人類(lèi)中產(chǎn)生至少10種可能的BCR，其數量遠超個(gè)體B淋巴細胞群體的規模。這個(gè)巨大的潛在序列多樣性是如何轉化為抗原特異性的呢？這個(gè)問(wèn)題目前尚未完全明朗。顯然，存在一定的冗余——并非每個(gè)獨一無(wú)二的VH-VL組合都會(huì )產(chǎn)生獨特的結合特異性。然而，想要知道改變結合特異性所需的氨基酸突變數量及其位置，目前我們還無(wú)法準確預測。

在駱駝、美洲駝和羊駝等駱駝科物種中，科學(xué)家們發(fā)現了一類(lèi)特殊的重鏈抗體，它們可能為我們提供了一個(gè)更易于研究的系統，因為這些抗體中完全沒(méi)有輕鏈的存在。其中，被稱(chēng)為納米抗體的可變VHH結構域（約為傳統抗體的1/10大?。?，展現出了相當高的穩定性，并且能夠結合酶活性位點(diǎn)，病毒衣殼以及G蛋白偶聯(lián)受體中難以接近的表位。駱駝的VHH結構域與Ab的VH結構域在功能上同源，都包含三個(gè)高度可變的環(huán)H1、H2和H3。這三個(gè)環(huán)在折疊蛋白結構域的一側形成了擴展的結構界面，為抗原結合界面或旁位提供了空間，從而決定了Nb的抗原結合特異性。相較于六個(gè)在抗體 VH-VL結構域復合物中高度可變的環(huán)，這三個(gè)環(huán)的潛在序列多樣性明顯更小，這也使得駱駝的VHH結構域在與抗原結合時(shí)的特異性更易于掌握和控制。

傳統和駱駝形重鏈Abs的結構特征

對于納米抗體（nanobody，Nb）和傳統抗體（Abs）來(lái)說(shuō)，最大的挑戰在于解析出將氨基酸序列（特別是副位殘基的挑選）與折疊分子的結合特異性相關(guān)聯(lián)的分子密碼。在常規的抗體中，副位通常會(huì )出現在VH和VL結構域的結合處，通常會(huì )涉及到多達六個(gè)不同的高變環(huán)區域的殘基。此外，VH和VL結構域的結合方式也有很大的靈活性，使得抗體能夠盡可能地增加潛在抗原結合表位的多樣性。相比之下，納米抗體（nanobody，Nb）的副位則完全包裹在VHH結構域內部，這樣便大大限制了潛在抗原結合表位的空間多樣性，而不過(guò)多地影響其結合特異性的多樣性。實(shí)際上，納米抗體（nanobody，Nb）通常會(huì )與其靶抗原緊密結合，其親和力也與典型單克隆抗體相仿。盡管納米抗體（nanobody，Nb）體積小巧且結構單一，但是它們是如何實(shí)現如此多樣化的結合特異性的呢？

為了解決這個(gè)問(wèn)題，研究人員建立了兩個(gè)共晶蛋白復合物結構的數據集，每個(gè)數據集都包含納米抗體（nanobody，Nb）抗原或傳統抗體（Ab）抗原蛋白復合物。數據集由90個(gè)非冗余蛋白質(zhì)結合納米抗體（nanobody，Nb）組成，PDB中具有納米抗體（nanobody，Nb）抗原共晶體結構。

Nb結構多樣性與Ab結構多樣性的比較

為了量化納米抗體（nanobody，Nb）VHH結構域和傳統抗體（Ab） VH結構域不同部分的結構變異性，研究人員對抗原接觸殘基的結構比對與鑒定；確定了納米抗體（nanobody，Nb）抗原和傳統抗體（Ab）抗原復合物的90種共晶體結構，分析了抗原結合構象中的納米抗體（nanobody，Nb）和傳統抗體（Ab）結構變化。

通過(guò)對納米序列的研究分析發(fā)現，米抗體（nanobody，Nb）在其框架區域的序列和結構上更加保守，這表明米抗體（nanobody，Nb）沒(méi)有很大程度地利用框架來(lái)增加可以編碼的結合特異性的數量。那么，為何納米抗體（nanobody，Nb）的序列長(cháng)度縮短且單域結構緊湊，但依然產(chǎn)生如此多樣化的結合特異性呢？

傳統抗體結構中六個(gè)超變量環(huán)是確定Ab相互作用特異性的關(guān)鍵；相比之下，納米抗體（nanobody，Nb）只有三個(gè)高變環(huán)，減少了可能的序列變異的空間，從而減少了潛在的相互作用特異性。因此，研究人員提出了三種潛在機制。

第一種機制與納米抗體（nanobody，Nb） H1和H2環(huán)所表現出的顯著(zhù)增加的結構多樣性有關(guān)。這些環(huán)并不比傳統抗體（Ab）環(huán)表現出更大的序列變異，但結構分析表明，它們確實(shí)表現出更大的結構變異。與傳統抗體（Ab）相比，這種結構多樣性可能是由于不同的環(huán)序列特征——例如，較少的納米抗體（nanobody，Nb）H1環(huán)含有穩定的F29，而納米抗體（nanobody，Nb） H2環(huán)使用更大比例的小殘基，這增加了結構的靈活性。無(wú)論納米抗體（nanobody，Nb）如何取樣更多種類(lèi)的環(huán)主鏈構象，事實(shí)是它們對實(shí)現高特異性抗原結合的能力做出了重要貢獻。

其次，根據研究數據顯示，納米抗體（nanobody，Nb）編碼的每個(gè)氨基酸殘基的序列多樣性比傳統抗體（Ab） H3環(huán)多7%左右。更長(cháng)的H3環(huán)被認為能夠使Nbs通過(guò)延伸到表位腔內的手指狀突起與抗原結合。這些發(fā)現表明，納米抗體（nanobody，Nb）利用其H3環(huán)中增加的多樣性，使它們能夠產(chǎn)生與它們受到挑戰的抗原緊密特異性結合的能力。

研究人員基于共晶結構數據提出第三種機制，從比VH結構域更大的范圍內繪制旁位殘基的能力將促進(jìn)抗原結合界面的形狀和物理性質(zhì)的多樣性，使納米抗體（nanobody，Nb）能夠使用更廣泛的表面，通過(guò)不同的結合模式與同源抗原相互作用。

總之，納米抗體（nanobody，Nb）似乎并沒(méi)有通過(guò)增加框架中的序列或結構多樣性來(lái)產(chǎn)生特異性的多樣性。這表明在小蛋白區域的分子特異性能力比我們基于經(jīng)典抗體的預期要高得多，這表明使用相對受限的短氨基酸序列與多種靶標產(chǎn)生高親和力特異性結合的潛力令人興奮。

參考文獻：

Laura S. Mitchell, Lucy J. Colwell,Comparative analysis of nanobody sequence and structure data,PROTEINS:Structure, Function, and Bioinformatics,Volume86, Issue7,July 2018,Pages 697-706