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單克隆抗體技術(shù)是現代生命科學(xué)研究的重要工具，其在蛋白質(zhì)的結構與功能研究、疾病診斷、藥效學(xué)及臨床應用等方面有著(zhù)不可或缺的作用。近年來(lái)，隨著(zhù)分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)的發(fā)展，單個(gè)B細胞抗體制備技術(shù)開(kāi)始興起，并逐漸得到廣泛應用。單個(gè)B細胞抗體技術(shù)制備的單克隆抗體所具有的全人源性、自身高度特異性和均一性的特點(diǎn)在治療病原微生物感染、腫瘤、自身免疫性疾病和器官移植等方面顯出了獨特的優(yōu)勢和良好的應用前景。
Xten™MabSingleB兔單克隆抗體開(kāi)發(fā)以單個(gè)B細胞為起始點(diǎn)，利用每個(gè)B細胞只產(chǎn)生一種特異性抗體的特性，直接從免疫的兔子中通過(guò)隨機分離和抗原特異性分離兩種方式從外周血或淋巴組織中分離單B細胞，從單個(gè)B細胞中擴增出抗體基因，進(jìn)而獲得抗原特異性抗體。該技術(shù)所制備的抗體具有高通量、高效率、高穩定性、高特異性等優(yōu)點(diǎn)，保留了豐富的基因多樣性和輕重鏈可變區的天然配對，應用前景廣泛，是最高效的抗體篩選方法之一。特別是在快速應對病原微生物傳染病的抗體開(kāi)發(fā)上有著(zhù)巨大優(yōu)勢。基于單個(gè)B細胞技術(shù)的Xten™MabSingleB兔單克隆抗體開(kāi)發(fā)有三個(gè)主要流程，鑒定和分離單個(gè)B細胞；擴增和克隆抗體基因；表達、篩選和鑒定抗原特異性抗體。
鑒定和分離單個(gè)B細胞
目前普遍運用于抗原特異性單個(gè)B細胞分離的方法包括：熒光標記抗原多參數細胞分選法
(Fluorochrome-labeledantigensviamultiparameter，FACS)、抗原標記磁珠分選法(Antigencoatedmagneticbeads)、微雕法(Microengraving)以及細胞微陣列芯片法(Cell-basedmicro-arraychipsystems)。
熒光標記抗原多參數細胞分選法與熒光激活細胞分選法類(lèi)似，二者差異在于前者在加入用于標記B細胞表面抗原的熒光抗體之外，還需加入熒光標記的目標抗原用來(lái)結合B細胞表面的膜抗體，以分選目標抗原特異性的B細胞。它可以高速分析上萬(wàn)個(gè)細胞，并能同時(shí)從一個(gè)細胞中測得多個(gè)參數，此技術(shù)不僅提高分離細胞的純度，而且可以得到更多的細胞信息，分選各個(gè)時(shí)期的B細胞用于不同的研究方向。該方法具有速度快、精度高、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，已成為當代最先進(jìn)的細胞定量分析分選技術(shù)。
抗原標記磁珠分選法基本原理是基于細胞表面目標抗原特異性抗體能與連接有磁珠的目標抗原相結合，在外加磁場(chǎng)中，通過(guò)目標抗原與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，無(wú)該種表面特異性抗體的細胞由于不能與連接著(zhù)磁珠的目標抗原結合而沒(méi)有磁性，不在磁場(chǎng)中停留，從而使細胞得以分離。這種方法可以在幾分鐘內從復雜的細胞混合物中分離出高純度的細胞，在流式分選單細胞前可用磁珠分選法進(jìn)行預分離，但是由于磁珠影響細胞生物活性因而不利于分離后培養與操作。
微雕法基于軟光刻(Softlithographic)微陣列芯片識別、恢復和克隆產(chǎn)生抗原特異性抗體的B細胞，刺激多克隆B細胞產(chǎn)生抗體并將其逐個(gè)置于芯片孔內，將該芯片轉印至相應的蛋白芯片后，即可用熒光標記的目標抗原識別特異性抗體，進(jìn)而顯微操作將檢測到的分泌目標抗原特異性抗體B細胞轉移到細胞培養皿中進(jìn)行后續克隆操作。
微陣列芯片法同微雕法具有高通量(每個(gè)芯片分選細胞量高達10萬(wàn)個(gè)細胞)、快速、成本低、可直接從多克隆B細胞中分選并鑒定抗體分泌B細胞等優(yōu)點(diǎn)。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)微陣列芯片法(Immunospotarrayassayonachip，ISAAC)是微陣列芯片法的延伸和補充，該方法用包被于芯片表面的抗免疫球蛋白抗體來(lái)代替微雕法轉印蛋白芯片的過(guò)程，抗免疫球蛋白抗體能夠快速捕捉抗體分泌B細胞分泌的抗體，進(jìn)而用生物素標記的目標抗原識別特異性抗體，從而達到篩選并分離特異性抗體分泌B細胞的目的。ISAAC法較微雕法另一改進(jìn)在于，前者能在同一塊芯片上篩選針對多種不同目標抗原的特異性抗體，簡(jiǎn)化了實(shí)驗過(guò)程且更加高效，是目前前景非常廣闊的分選B細胞方法。
擴增和克隆抗體基因
經(jīng)典克隆未知抗體基因的方法（如cDNA文庫篩選等）有著(zhù)共同的缺點(diǎn)——操作繁瑣、周期較長(cháng)、工作量大。近些年隨著(zhù)PCR技術(shù)的快速興起和成熟，單個(gè)B細胞抗體基因的擴增和克隆也隨之發(fā)展。
細胞分選時(shí)，通常需將單個(gè)B細胞分至內含適量細胞裂解液、RNA酶抑制劑和PCR反應試劑的適當容器中，如96孔板。由于單個(gè)細胞內RNA含量少，適當的容器可以方便大批量操作防止樣品損失或交叉污染。另外，不同類(lèi)型B細胞抗體分泌能力差異明顯，如抗體分泌B細胞中抗體基因轉錄本含量遠高于記憶B細胞，因此從抗體分泌B細胞中更容易擴增得到抗體基因。
通常從單個(gè)B細胞中擴增未知抗體基因，需使用合適的引物進(jìn)行巢式或半巢式逆轉錄PCR(Nestedorsemi-nestedRT-PCR)，該過(guò)程要求引物具有通用性、靈敏性、特異性，能避免非特異性擴增又能擴增出完整的抗體基因序列，因此合理設計引物序列至關(guān)重要。通常針對抗體重鏈輕鏈可變區不同前導序列設計前向引物的混合物，反向引物特異性互補于抗體恒定區。根據實(shí)驗目的，如果分離和擴增不同同種型的抗體，反向弓物則是特異性互補于各種同種型抗體恒定區的混合物。除此之外，為方便重疊延伸PCR重組和酶切克隆抗體重鏈輕鏈可變區基因，前向引物5端和反向引物3端需要包含限制性?xún)惹忻肝稽c(diǎn)。
表達、篩選和鑒定抗原特異性抗體
鑒定抗體的抗原特異性和生物活性前需將攜帶有抗體基因的表達載體在相應系統中表達，最簡(jiǎn)單常用的是原核表達系統，如Escherichiacoli，相較而言，真核表達系統尤其是哺乳動(dòng)物細胞表達系統更有利于抗體的加工修飾，其產(chǎn)物的生物活性可靠性更高，常用的有HEK293和CHO等細胞系。通過(guò)親和層析和離子交換層析純化到的抗體，可通過(guò)SDS-PAGE，Westernblotting，ELISA等常規方法篩選和鑒定抗體，也可通過(guò)免疫沉淀(Immunoprecipitation)、空斑法(Plaqueassay)、空斑減少中和測定法(PRNT50assay)、流式分析法(FACSanalysis)、活細胞成像測定法(Livecellimagingassays)、體內藥物活性測定法等方法進(jìn)一步測定抗體與抗原的特異性、親和力以及中和活性保護活性等生物學(xué)特性。
在過(guò)去的40年里，隨著(zhù)單克隆抗體在各個(gè)領(lǐng)域的研究和應用日趨廣泛。而近10年來(lái)，隨著(zhù)基于單細胞的抗體制備相關(guān)技術(shù)的開(kāi)發(fā)和完善，單個(gè)B淋巴細胞抗體制備技術(shù)已逐漸成為單克隆抗體制備的主要技術(shù)。單個(gè)B淋巴細胞抗體制備技術(shù)作為未來(lái)單克隆抗體制備的主流技術(shù)，各階段的方法和環(huán)節都存在著(zhù)極大的進(jìn)展空間，所制備的單克隆抗體也具有無(wú)限的開(kāi)發(fā)和應用前景。
參考文獻
ChiXY，YuCM，ChenW.SingleBcellmonoclonalantibodytechnologiesandapplications.ChinJBiotech，2012，28(6):651−660.
