鞭毛重組蛋白A干擾巨噬細胞自噬的機制研究

嗜肺軍團菌（legionella pneumophila，LP）是一類(lèi)單極鞭毛革蘭陰性桿菌，能引發(fā)軍團病。LP可入侵人肺泡巨噬細胞，阻礙巨噬細胞自噬，躲避巨噬細胞對其徹底清除，并在巨噬細胞內增殖，達到感染宿主的最終目標。LP 的脂多糖、菌毛、鞭毛等都與軍團菌的致病性相關(guān)，鞭毛蛋白是其重要的毒力因子，可加強病原菌的侵襲。
鞭毛蛋白是 Toll 樣受體 5（TLR5）的特異性配體，TLR5 作為模式識別受體，在致病菌侵襲宿主時(shí)，TLR5 依靠胞外的 LRR 蛋白結構域（LRR domain）識別鞭毛蛋白，并觸發(fā)依賴(lài)髓樣分化因子 88（MyD88）的信號通路，激活微管相關(guān)蛋白激酶（microtubule -associated protein kinase，MAPK）和核轉錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB）誘導的炎性反應，有效清除病原體。

來(lái)自寧夏醫科大學(xué)基礎醫學(xué)院、銀川市第三人民醫院的研究人員在此前的研究中，使用LP 鞭毛重組蛋白A（rflaA）干預RAW264.7巨噬細胞，發(fā)現組蛋白去乙?；?/font>6（histone deacetylase 6，HDAC6）增高。HDAC6是一種位于細胞質(zhì)的去乙?；?，參與多種生物過(guò)程的調控，包括自噬、熱休克反應和腫瘤進(jìn)展等。HDAC6還參與了線(xiàn)粒體吞噬和錯誤折疊蛋白向溶酶體和蛋白酶體的運輸。為了探究HDAC6在rflaA抑制巨噬細胞自噬中的作用，研究人員選擇 HDAC6-/-C57BL/6J 小鼠巨噬細胞作為此次實(shí)驗的研究對象。

采用支氣管肺泡灌洗法提取C57BL/6J與HDAC6-/-C57BL/6J兩種小鼠巨噬細胞，用小鼠巨噬細胞表面標記物F4/80鑒定；純化rflaA，CCK-8 法檢測其對小鼠巨噬細胞半數抑制濃度（IC50），篩選最佳作用濃度用于后續實(shí)驗；rflaA分別干預C57BL/6J 及HDAC6-/-C57BL/6J小鼠巨噬細胞6、12和24 h，RT-qPCR、Western blot 及免疫熒光檢測各組自噬相關(guān)因子自噬效應蛋白1（Be－clin1）、自噬相關(guān)蛋白 5（ATG5）、自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈 3（LC3）、SQSTM1 蛋白（P62）的表達水平。

根據CCK-8結果計算，IC50為0.41 μg·μL-1，最佳作用濃度為0.041 μg·μL-1用于后續實(shí)驗；RT-qPCR、Westernblot、免疫熒光結果顯示，rflaA干預C57BL/6J小鼠巨噬細胞后，與0 h相比，6、12、24 h HDAC6的表達水平升高，LC3、ATG5表達水平均降低，P62的表達水平升高，Beclin1的表達水平先降低后升高（P 均＜0.05）；rflaA干預HDAC6-/-C57BL/6J小鼠巨噬細胞后，與0 h 相比，6、12、24 h LC3、ATG5、Beclin1表達水平均升高，P62的表達水平降低（P均＜0.05）；在相同的時(shí)間點(diǎn)，與C57BL/6J小鼠巨噬細胞各組相比，HDAC6敲除后各組細胞ATG5、LC3 表達水平升高，Beclin1先升高后降低，P62降低（P均＜0.05）。

小鼠巨噬細胞免疫熒光鑒定（免疫熒光染色×200）

 RT-qPCR 檢測敲除 HDAC6 對 rflaA 干預小鼠巨噬細胞不同時(shí)間點(diǎn)自噬相關(guān)因子 mRNA 表達的影響

Western blot 檢測敲除 HDAC6 對 rflaA 干預小鼠巨噬細胞不同時(shí)間點(diǎn)自噬相關(guān)因子蛋白表達的影響

LP rflaA干預C57BL/6J小鼠單核巨噬細胞后，能抑制其自噬，提示rflaA可能被TLR5識別，激活炎癥小體使巨噬細胞內脂質(zhì)化的LC3脫脂，特異性地阻斷LC3-PE和ATG5相互作用，脫脂后的LC3未與溶酶體融合，從而阻斷自噬體-溶酶體途徑，LC3、ATG5的表達降低，吞噬體-溶酶體融合受損導致P62積累，積累的P62會(huì )與HDAC6結合通過(guò)泛素結合區來(lái)維持其去乙?；富钚?，導致α-tubulin的去乙?；?，P62通過(guò)維持HDAC6活性使微管不穩定從而抑制自噬。
隨著(zhù)時(shí)間發(fā)展，巨噬細胞的功能逐漸恢復，rflaA的抑制作用減弱，HDAC6 的活性開(kāi)始恢復，表達水平升高，誘導表達的Be－clin1表達水平升高，Beclin1-PIK3C3復合體形成增多，自噬活性開(kāi)始逐漸恢復。
HDAC6作為一種去乙?；?，當HDAC6敲除后，rflaA對巨噬細胞自噬的抑制作用降低，巨
噬細胞乙?；饔迷鰪?，微管蛋白穩定性增加，微管的運輸功能恢復，有助于恢復自噬通量，乙?；?/font>P300乙?；揎?/font>LC3，導致LC3表達增加。細胞自噬途徑激活LC3表達上調后，自噬誘導Beclin1的乙?；饔迷鰪?，Beclin1乙?；軌虼龠M(jìn)自噬體的成熟和降解，自噬小體和自噬溶酶體融合順暢，自噬作用增強，Beclin1表達升高。而LC3靶向自噬體膜是由ATG5 決定的，ATG5的表達也相應升高。
HDAC6和P62作為泛素結合蛋白，參與自噬調控。HDAC6 催化從各種細胞質(zhì)蛋白中去除乙?；?，并包含一個(gè)泛素結合域，通過(guò)此結合域將錯誤折疊和損壞的蛋白靶向到自噬小體中。當細胞蛋白質(zhì)被破壞時(shí)，聚集體的形成就會(huì )發(fā)生。聚集體的形成是一種對錯誤折疊損傷蛋白的細胞保護反應，并通過(guò)自噬誘導其清除。這些蛋白酶體與P62共定位，并通過(guò)選擇性巨自噬被清除，所以當敲除HDAC6后，為了促進(jìn)泛素聚集體和自噬降解，P62為了招募吞噬體膜上的LC3膜蛋白用于自噬體成熟，而自身被自噬降解，故自噬底物P62減少，P62的表達下調。

這充分表明，HDAC6 促進(jìn)rflaA抑制小鼠巨噬細胞自噬，HDAC6可能通過(guò)影響微管蛋白乙?；蓴_巨噬細胞自噬。這項研究為HDAC6在rflaA干擾巨噬細胞自噬中的影響提供新的思路，為進(jìn)一步了解HDAC6在LP鞭毛蛋白致病機制中的作用奠定基礎。

參考文獻
ZHENG Ronghui,LI Pan,CAO Xiuqin,CHEN Minjia,CHEN Haixia,YANG Zhiwei.HDAC6 Regulates Flagellar Recombinant Protein A Interference Macrophage Autophagy[J].Ningxia Medical University,2023(06):573-580592.doi:10.16050/j.cnki.issn1674-6309.2023.06.006