用于疾病的人源化抗體制備技術(shù)的發(fā)展

單克隆抗體（monoclonalantibody，mAb）B細胞產(chǎn)生的、由兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈組成的Y形結構蛋白。其中抗原結合片段（antigenbindingfragments，Fab）由一條重鏈和一條輕鏈的6個(gè)互補決定區（complementarity-determiningregion，CDR）組成。Fab段決定了抗體結合抗原的特異性和親和力；單抗的恒定區（Fc）通過(guò)結合細胞表面Fc受體來(lái)發(fā)揮抗體依賴(lài)的細胞介導的細胞毒性作用（antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC）、補體依賴(lài)的細胞毒性作用（complementdependentcytotoxicity，CDC）等功能。

目前，治療性單抗已廣泛應用于癌癥、自身免疫性疾病、傳染病等多種疾病，為許多患者帶來(lái)了全新的希望。但由于人抗鼠（humanantimouseantibody，HAMA）反應的存在，抑制了鼠單抗的臨床應用，因此涌現了一系列抗體工程技術(shù)，如抗體人源化、噬菌體展示、轉基因小鼠、單細胞PCR等技術(shù)，可以實(shí)現鼠單抗人源化改造以及親和力提高，或者直接篩選制備人源化/全人抗體，加速了單抗的臨床轉化和應用。

抗體人源化
全人源、人源化和鼠源抗體分別占臨床應用單抗的51%、46%和3%，可見(jiàn)人源化和全人源單抗已經(jīng)成為治療性抗體研發(fā)的主流。人源化抗體具有免疫原性低，體內半衰期長(cháng)，有效誘導ADCC、CDC效應等優(yōu)點(diǎn)。早期的人源化技術(shù)是將鼠單抗的可變區與人抗恒定區相連從而獲得嵌合抗體。選擇性阻斷血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體的阿昔單抗（Abciximab）于1994年被美國FDA批準用于抑制血小板聚集，成為第一個(gè)嵌合抗體藥物，抗CD20嵌合抗體利妥昔單抗于1997年被美國FDA批準用于非霍奇金淋巴瘤，成為首個(gè)用于腫瘤的嵌合抗體。
為了提高抗體人源化程度，CDR移植技術(shù)應運而生，將除了CDR區以外的序列替換為人源（如果鼠抗FR框架中的某些氨基酸對維持抗原的識別至關(guān)重要，那么這些殘基也需要保留），進(jìn)一步降低免疫原性。如FDA于1997年批準的首個(gè)用于預防移植排斥反應的人源化單抗——抗IL-2受體抗體達利珠單抗（Daclizumab），而最著(zhù)名的人源化抗體當屬1998年獲批的抗HER2單抗曲妥珠單抗（Herceptin），從誕生以來(lái)連續登上十大藥物暢銷(xiāo)榜。
目前，普健生物提供完善的抗體人源化服務(wù)，僅需提供原始抗體序列，普健可幫助客戶(hù)通過(guò)成熟的方法分析抗原-抗體復合物的結構，了解直接作用的關(guān)鍵殘基，完成人源化抗體設計，通過(guò)一站式抗體平臺完成基因合成及克隆、瞬轉表達純化等服務(wù)，并形成實(shí)驗報告。
服務(wù)優(yōu)勢
1、普健生物擁有經(jīng)驗豐富的抗體人源化團隊，團隊的技術(shù)專(zhuān)家曾經(jīng)成功研制上市的治療性抗體藥物
2、普健生物擁有自主開(kāi)發(fā)的高表達載體及細胞系，以及具有商業(yè)開(kāi)發(fā)license的細胞系
3、普健生物具有一站式從細胞系開(kāi)發(fā)，到發(fā)酵培養條件優(yōu)化，再到150L細胞罐發(fā)酵，完成整個(gè)治療性抗體的研發(fā)能力


噬菌體展示技術(shù)
噬菌體展示技術(shù)是基于噬菌體表面蛋白（如PⅢ蛋白）的結構及包裝特點(diǎn)，將外源抗體基因和外殼蛋白融合表達并展示在鞭毛表面，實(shí)現靶抗原特異性抗體的快速篩選。1985年，GeorgeP.Smith使用重組DNA技術(shù)，將外源肽與噬菌體M13的外殼蛋白PⅢ融合，在噬菌體表面展示肽。此后他創(chuàng )建了“抗體選擇性噬菌體載體”，能夠從1×10⁸庫容噬菌體池中篩選特異性抗體。噬菌體展示抗體的形式可以是單鏈抗體（singlechainantibodyfragment，scFv）或Fab片段，scFv由VH和VL組成，二者之間由一個(gè)短而靈活的連接肽相連，而Fab具有相對較高的穩定性，其結合能力與完整的IgG抗體相當。
由于噬菌體顆粒小、容易擴增和富集，溶解度高（1×10¹³pfu/mL），因此可以實(shí)現抗體的大容量展示。噬菌體展示文庫的基因庫可以從原始或免疫人類(lèi)或動(dòng)物中獲得，也可以使用隨機CDR合成法構建文庫，只要庫容足夠大，都可以產(chǎn)生針對多種抗原靶點(diǎn)的高親和力抗體（親和力達納摩爾級）。普健生物基于豐富的噬菌體抗體技術(shù)經(jīng)驗以及上百個(gè)噬菌體展示抗體項目成功開(kāi)發(fā)經(jīng)驗，具有全人源重組抗體庫，庫容高達千億級別(10¹¹pfu），支持兩步建庫法，保證了文庫的多樣性，抗體庫片段插入正確率高，可以?xún)芍苣玫饺嗽粗亟M抗體，并支持構建多種物種(人源、小鼠、兔子、羊駝等)、多種類(lèi)型(scfv、Fab、VHH等)的抗體文庫。


FDA已經(jīng)批準了多種從噬菌體展示文庫中獲得的全人源抗體。如2002年獲批上市的阿達木單抗（Adalimumab），迄今仍是世界上最暢銷(xiāo)的藥物。

轉基因動(dòng)物
轉基因動(dòng)物是全人源抗體的又一重要來(lái)源，通過(guò)對細胞系進(jìn)行基因改造，將人類(lèi)免疫球蛋白（Ig）基因取代動(dòng)物內源性Ig基因，使這些動(dòng)物在免疫后能夠合成人類(lèi)抗體。首個(gè)轉基因小鼠來(lái)源的全人抗體帕尼單抗（Panitumab）是抗EGFR抗體，于2006年獲得美國FDA批準。同樣來(lái)源于轉因因動(dòng)物技術(shù)的還有2種用于自身免疫性皮膚病的人抗：IL-17α抗體司庫奇尤單抗（Secukinumab）以及IL-17R抗體柏達魯單抗（Brodalumab），分別于2015年和2017年獲得美國FDA批準用于銀屑病。

單B細胞抗體技術(shù)
使用傳統的雜交瘤技術(shù)、抗體庫或轉基因小鼠技術(shù)生產(chǎn)治療性人類(lèi)抗體往往需要長(cháng)期的免疫程序和多輪篩選，而單細胞抗體技術(shù)可以從外周血中直接進(jìn)行陽(yáng)性細胞分選和抗體基因克隆，直接進(jìn)入哺乳動(dòng)物細胞表達步驟，因此在突發(fā)傳染病等緊急情況下，單B細胞抗體技術(shù)的優(yōu)勢尤為明顯。普健生物新型的Xten™MabSingleB兔單克隆抗體開(kāi)發(fā)技術(shù)平臺，利用B細胞分選富集策略，在流式分選設備的支持下，有效富集抗原特異性B細胞，提高B細胞體外培養的成活率，保留B細胞的多樣性，可開(kāi)發(fā)出不同應用需求的抗體。
案例展示：

總體而言，治療性抗體領(lǐng)域發(fā)展迅速，擁有巨大的發(fā)展潛力?；谝延械膯慰寡邪l(fā)技術(shù)，結合下一代測序技術(shù)、高通量篩選、抗體恒定區改造技術(shù)，借鑒新型支架蛋白、修飾抗體以
及抗體分子設計等經(jīng)驗，可以最大限度地提高抗體藥物的療效和安全性，展現最優(yōu)藥效、藥代及藥理特性。

參考文獻
[1]FENGJiannan,QIAOChunxia.Progression on research technology of human therapeutic antibody.[J].Journal of Nanjing Medical University(Natural Sciences),2020,40(11):1571-1574.