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骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（Bone morphogenetic protein 4,BMP4）是骨形成蛋白家族的一員，隸屬于 TGF-β超家族，在調節胚胎發(fā)育、干細胞分化和成人組織穩態(tài)等方面起重要的調控作用。
在過(guò)往的研究中，Klösch等將鼠源BMP4在重組大腸桿菌中進(jìn)行了表達，但表達系統不能對外源蛋白進(jìn)行修飾，會(huì )形成不溶解、無(wú)活性的包涵體，并存在后期蛋白復性實(shí)驗煩瑣、復性率較低等問(wèn)題；Cha等將人源BMP4在中國倉鼠卵巢細胞中進(jìn)行了表達，結果證明哺乳動(dòng)物活細胞表達系統在大量生產(chǎn)蛋白時(shí)成本較高，不適合大規模生產(chǎn)的需求。在BMP4蛋白純化方面，普遍選擇使用親和層析技術(shù)，如免疫親和層析、染料－配體親和層析、固定化金屬離子親和層析等，但親和層析技術(shù)雖然操作方便，卻同樣存在成本較高、不宜大規模生產(chǎn)等問(wèn)題。因此，優(yōu)化BMP4表達方法、提高利用效率、降低純化成本，對后續研發(fā)和生產(chǎn)至關(guān)重要。
畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統是近年來(lái)發(fā)展迅速、應用廣泛的一種真核表達系統。它是甲醇營(yíng)養型酵母菌，有兩個(gè)乙醇氧化酶（Alcohol oxidase，AOX）編碼基因AOX1和AOX2，兩者序列相似，AOX1基因嚴格受甲醇誘導和調控。當甲醇為唯一碳源時(shí)，AOX1啟動(dòng)子可被甲醇誘導，啟動(dòng)乙醇氧化酶的表達，從而用甲醇進(jìn)行代謝，含AOX1 啟動(dòng)子的質(zhì)?？捎脕?lái)促進(jìn)編碼外源蛋白的目的基因的表達。在此研究中，來(lái)自吉林師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、吉林大學(xué)基礎醫學(xué)院的研究人員以骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP4）為研究對象，將BMP4基因與IgG Fc 基因結合，改造成為BMP4融合蛋白，經(jīng)畢赤酵母誘導表達和DEAE陰離子純化獲得目的蛋白，并利用間充質(zhì)干細胞驗證了其生理活性。
畢赤酵母表達系統是目前較為常見(jiàn)的表達系統之一，其優(yōu)點(diǎn)在于表達高效、穩定性好、生產(chǎn)成本低，可根據需要選擇胞內或胞外分泌路徑。其中，胞外分泌表達純化工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低，適用于工業(yè)生產(chǎn)。用不同質(zhì)量分數的甲醇對同一菌種進(jìn)行誘導并對重組蛋白純化進(jìn)行優(yōu)化。
離子交換層析方法可以根據電荷性質(zhì)差異分離電離分子，具有處理能力強、適用廣泛、成本
適中等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還有易于放大和自動(dòng)化處理等特性，在大批量生產(chǎn)中發(fā)揮重要的作用。采用離子交換層析法分離、純化目的蛋白，通過(guò)BMP4形成二聚體時(shí)具有促進(jìn)間充質(zhì)干細胞增殖的特性，驗證了BMP4-Fc融合蛋白的活性。
畢赤酵母表達系統可對目的蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，具有高效分泌表達的真核表達系統。畢赤酵母表達系統主要優(yōu)勢：
1. 含有特有的強有力的 AOX（醇氧化酶基因）啟動(dòng)子，用甲醇可嚴格地調控外源基因的表達
2. 產(chǎn)物易分離，畢赤酵母所用發(fā)酵培養基十分廉價(jià)，一般碳源為甘油或葡萄糖及甲醇，其余為無(wú)機鹽，培養基中
不含蛋白，有利于下游產(chǎn)品分離純化
3. 外源蛋白基因遺傳穩定，外源基因能以高拷貝數整合到畢赤酵母基因組中，不易丟失并能夠得到高表達菌株
4. 作為真核表達系統，畢赤酵母具有真核生物的亞細胞結構，具有糖基化、脂肪?；?、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能
該項研究進(jìn)一步純化了重組蛋白、優(yōu)化了DEAE離子交換層析條件，發(fā)現在230mmol/L NaCl和20mmol/L Tris-HCl混合液洗脫條件下，可以除去大部分雜蛋白，得到純度較高、生理活性好、接近商業(yè)化純品水平的目的蛋白，為BMP4的進(jìn)一步研究、開(kāi)發(fā)和利用提供了參考依據。
參考文獻：
[1].ZHAO Zhuo,JI Hao-tian,XIAO Ye-chen.Vector construction and purification analysis on recombinant BMP4 protein in Pichia pastoris.[J].JournalofNortheastNormalUniversity(NaturalScienceEdition)Vol.54No.1.March 2022
