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抗原特異性B細胞群體是發(fā)現治療性單克隆抗體（mAb）的關(guān)鍵資源，源自自然感染的人類(lèi)或人工免疫后的動(dòng)物（包括小鼠、大鼠、雞、兔和羊駝），這些細胞大多從供體血液樣本或免疫后的小鼠脾臟中分離。今天，小編將帶領(lǐng)大家一起深入探究這些常規單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)，了解它們是如何從實(shí)驗室走向世界的每一個(gè)角落，成為守護健康的強大武器。
雜交瘤技術(shù)
由1984年諾貝爾獎得主Cesar Milstein和Georges Kohler于1975年創(chuàng )立，成為了1986年美國食品和藥品監督管理局（FDA）核準的第一個(gè)抗體Muromonab-CD3（商品名OKT3）的孵化搖籃。此技術(shù)的核心在于運用電融合法或化學(xué)介導的融合，使原初B細胞與骨髓瘤細胞（一種B細胞惡性腫瘤細胞系）結合，實(shí)現B細胞的永生化。雜交瘤技術(shù)的一個(gè)潛在缺點(diǎn)是細胞融合過(guò)程的效率有限。融合后，單個(gè)B細胞克隆通常通過(guò)有限的稀釋進(jìn)行劃分。連續分泌IgG的克隆細胞允許對未純化的細胞上清進(jìn)行中等通量篩選，以鑒定具有所需結合活性的克隆，例如，利用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）進(jìn)行親和性驗證。雜交瘤技術(shù)之所以吸引人是因為它保留下了原本的VH/VL配對，且在治療性抗體應用方面取得了成功?，F有多款出自雜交瘤的單克隆抗體獲得了FDA的認可，成為市場(chǎng)上的治療藥物。該技術(shù)主要用于小鼠、大鼠和兔子的B細胞永生化。為了鑒定全人抗體候選物，XenoMouse、HuMab-mouse和Alloy-GKmouse等轉基因小鼠模型也為傳統雜交瘤技術(shù)提供了有價(jià)值的B細胞來(lái)源，并分離出了經(jīng)FDA批準的單克隆抗體?？傮w而言，雜交瘤技術(shù)仍然是挖掘治療性IgG的常見(jiàn)和可靠途徑。
單B細胞篩選
單B細胞篩選作為雜交瘤技術(shù)的有力替代，標準化的篩選流程包括：B細胞首先通過(guò)磁珠分選（MACS）進(jìn)行富集，根據細胞標記物標記抗原和抗體進(jìn)行正性和負性選擇，確保僅選取那些表達了目標抗原或抗體的細胞。隨后，采用熒光激活細胞分選（FACS）技術(shù)，精確無(wú)誤地每孔一個(gè)細胞，為了提取并解析完整的VH/VL基因對，將細胞內的RNA通過(guò)逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）轉換成cDNA形式，再通過(guò)PCR針對性擴增VH與VL編碼區，生成足夠數量的基因模板，進(jìn)行Sanger測序，優(yōu)選出的IgG隨即被克隆，表達，純化，最終篩選所需的生物學(xué)以及生物物理性質(zhì)。創(chuàng )新微流控技術(shù)更是讓單細胞水平的RT-PCR成為可能，一個(gè)流式細胞儀分選的抗原特異性B細胞池被劃分為每個(gè)微滴中的一個(gè)細胞，從而可以在微滴中進(jìn)行小型化的RT-PCR，繼而通過(guò)二代測序和BCR分析篩檢候選抗體IgG。對比雜交瘤，單B細胞篩選省去了細胞融合環(huán)節，避免了每十萬(wàn)細胞中只有一個(gè)存活分泌抗體B細胞的局限。
表面展示技術(shù)
除傳統的雜交瘤技術(shù)和單B細胞篩選外，體外表面展示技術(shù)，特別是噬菌體和酵母展示，成為高通量篩選抗體片段的有力工具。
噬菌體展示：最早也是最廣泛應用的形式之一，利用噬菌體作為展示載體，將肽段或蛋白質(zhì)插入噬菌體外殼蛋白的基因中，使目的肽與噬菌體顆粒的表面展示出來(lái)。這一方法可用于篩選抗體、激酶抑制劑等。
酵母展示：使用釀酒酵母或其他真核微生物作為宿主，展示出來(lái)的蛋白質(zhì)更接近天然構象，適合篩選具有復雜折疊和糖基化修飾的蛋白質(zhì)，如抗體。
細菌展示：通過(guò)改造細菌如大腸桿菌的膜蛋白，使目的蛋白在細胞表面表達，適用于高通量篩選和蛋白質(zhì)工程。
體外表面展示技術(shù)不僅適用于抗原經(jīng)驗豐富的抗體庫，還適用于原始抗體庫的篩選。后者的一個(gè)顯著(zhù)優(yōu)點(diǎn)在于避免了構建完整免疫應答所需耗時(shí)（數周乃至數月），這一點(diǎn)在應對傳染病時(shí)尤為重要。相比而言，從原始基因庫（>10^10變異體）中篩選，更能迅速獲取高親和力抗體。篩選大規模、多樣化的原始庫，分離出的克隆親和力通常與文庫規模呈正相關(guān)，顯示出在傳染病治療性抗體發(fā)現中的實(shí)用性，如針對SARS-CoV-2的情況所示。
相較于雜交瘤技術(shù)和單細胞篩選，表面展示技術(shù)因其易于進(jìn)行多次循環(huán)篩選的特點(diǎn)，能有效精選出高親和力、高選擇性的克隆。多項FDA批準的單克隆抗體，如著(zhù)名藥物Humira（阿達木單抗），正是得益于此類(lèi)技術(shù)而得以發(fā)現。
從雜交瘤到單細胞技術(shù)，再到表面展示，每一階段都為抗體發(fā)現開(kāi)辟新徑，促進(jìn)免疫學(xué)研究與治療性抗體開(kāi)發(fā)。
