納米抗體在小分子化合物檢測的應用

1993年科學(xué)家首次報道了駱駝中存在一種天然缺失輕鏈、通過(guò)重鏈上的可變區結合抗原的重鏈抗體（heavy chain antibodies，HCAb），之后陸續在羊駝、單峰駝和美洲駝等駝科，以及鯊魚(yú)、鰩魚(yú)等軟骨魚(yú)中同樣發(fā)現了類(lèi)似結構的抗體。人們在重鏈抗體可變區片段（variable domain of the heavy chain of heavy- chain antibody， VHH） 基礎上開(kāi)發(fā)了一種僅由重鏈可變區構成的單域抗體（single domain antibody， sdAb），長(cháng)4 nm，直徑2.5 nm，分子量為12–15 kDa，是目前已知最小的活性抗原結合蛋白，僅為傳統抗體大小的十分之一，也被稱(chēng)為納米抗體（nanobody，Nb），其獨特的結構和優(yōu)越的特性使其成為多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

納米抗體在環(huán)境污染物、生物毒素等小分子化合物的檢測中不僅降低了檢測下限，提高了靈敏度和精確度，而且通過(guò)優(yōu)化測定過(guò)程，能夠實(shí)現快速簡(jiǎn)便的檢測，推動(dòng)免疫檢測方法和傳感技術(shù)的快速發(fā)展，納米抗體（nanobody，Nb）在競爭性ELISA法、免疫PCR、熒光偏振免疫分析和橫流免疫分析等免疫檢測技術(shù)的研發(fā)中取得了許多積極成果。

中國農業(yè)大學(xué)Liu等用半抗原CBR1與鑰孔血藍蛋白（keyhole limpet hemocyanin， KLH） 偶聯(lián)，將CBR1-KLH進(jìn)行皮下免疫羊駝，然后經(jīng)提取總RNA、PCR擴增VHH片段、酶切、轉化等步驟后成功構建VHH庫，構建的文庫大小約為1×10⁸ CFU/mL，經(jīng)過(guò)洗脫、淘選、純化等一系列過(guò)程后制備了甲萘威特異性VHHs，開(kāi)發(fā)了基于納米抗體（nanobody，Nb）的免疫測定方法檢測谷物中的廣譜氨基甲酸酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑甲萘威（carbaryl），且在谷物樣品中的可重復性和再現性良好?；?/font>納米抗體（nanobody， Nb）的小分子檢測在這項研究中具有一定的基礎應用。

納米抗體（nanobody， Nb）在農藥獸藥殘留以及重金屬檢測中表現出較高的應用價(jià)值。Li等研究發(fā)現納米抗體-堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP） 對除草劑2, 4-二氯苯氧基乙酸（2, 4-d） 表現出優(yōu)異的敏感性和特異性（IC50=29.2 ng/mL），2, 4-d深埋在CDR3和CDR2形成的袋中，NB3-9的結合袋通過(guò)氫鍵和疏水力與2, 4-d的相互作用，在此基礎上開(kāi)發(fā)了以納米抗體-堿性磷酸酶（AP） 融合為基礎的2, 4-d一步熒光酶免疫測定法（one-step fluorescent enzyme immunoassay， FLEIA），通過(guò)分析比較確定了FLEIA法可作為一種監測環(huán)境中2, 4-d殘留的便捷工具。3-苯氧基苯甲酸（3-PBA） 被廣泛用作人類(lèi)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑暴露的常見(jiàn)生物標志物，近期El-Moghazy等研制了一種基于納米抗體的新型電化學(xué)競爭免疫傳感器用于3-PBA的快速檢測，檢測限為0.64 pg/mL，檢測限遠低于膠體金/單克隆抗體/側向流動(dòng)免疫分析方法，LOD為130 ng/mL。

納米抗體（nanobody， Nb）在檢測食品和環(huán)境真菌毒素方面展現了強大的應用前景。Wang等開(kāi)發(fā)并優(yōu)化了PO8-VHH的納米抗體-多克隆抗體夾心ELISA法測定農產(chǎn)品中的曲霉病菌，能夠達到1 μg/mL濃度的檢測效果，進(jìn)而監測農產(chǎn)品曲霉污染。Tang等使用OTA和抗OTA Nb分別與兩種尺寸的高效熒光標簽-量子點(diǎn)（quantum dot， QD） 共價(jià)耦合，制備了OTA標記的GQD結合物（OTA-GQD） 和Nb28標記的RQD偶聯(lián)物（Nb-RQD） 分別作為能量供體和受體，如下圖所示，開(kāi)發(fā)出一種Nb-FRET（熒光共振能量轉移） 免疫傳感器用于檢測谷物樣品中赭曲霉毒素A （ochratoxin， OTA），易于表達、小尺寸的Nbs可以縮短兩個(gè)QD之間的有效距離，從而提高檢測靈敏度，單步測定可以在5 min內完成，檢測限為5 pg/mL。

Nb-FRET免疫傳感器

納米抗體的獲得主要通過(guò)免疫羊駝?dòng)裳蝰勼w內自身的抗體成熟階段來(lái)得到抗體基因，然后通過(guò)噬菌體展示篩選技術(shù)來(lái)從羊駝抗體庫中篩選得到最適合的抗體序列。整個(gè)流程主要包括羊駝免疫、噬菌體文庫構建和抗體篩選三個(gè)階段。

普健生物一站式抗體發(fā)現整體解決方案可為您提供完善的納米抗體定制服務(wù)，從抗原制備、羊駝免疫、噬菌體文庫構建、噬菌體文庫淘選、表達純化到抗體生產(chǎn)、親和力排序，為您交付高標準的噬菌體免疫文庫、陽(yáng)性菌株、VHH序列及技術(shù)服務(wù)報告等內容。如果您近期有納米抗體定制相關(guān)需求，歡迎撥打服務(wù)咨詢(xún)熱線(xiàn)027-87001869，我們將竭誠為您服務(wù)！

我們的優(yōu)勢：
自建養殖基地：每年近百頭成年羊駝?dòng)糜诿庖?，穩定提供大量的免疫抗原
庫容大：近千億級別天然庫
淘選周期短：最快在2周內可完成針對各類(lèi)靶點(diǎn)的特異性納米抗體快速篩選
親和力高：抗體親和力可達10^-9M 級別
樣本來(lái)源豐富：免疫庫源自百余只不同種類(lèi)的駝類(lèi)樣本-羊駝（Alpaca ）、駱駝（Camel）、美洲駝（Llama），提供更高抗體多樣性
超高品質(zhì)：插入正確率100%，序列正確率97%，隨機選取200個(gè)克隆測序，均無(wú)重復序列
可構建免疫庫，獲得更高親和力VHH序列

參考文獻：
SUN S, TAN X, PANG XY, LI M, HAO XJ. Recent advances in the application of nanobody technology: a review. Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(3): 855-867.