納米抗體之噬菌體文庫構建過(guò)程詳解

　　在羊駝納米抗體制備過(guò)程中，除了做好免疫和提取外，噬菌體文庫的構建也是其核心過(guò)程之一，只有做好了這個(gè)過(guò)程，才能獲得我們所需的抗體庫。那么，在提取淋巴細胞之后，如何構建噬菌體文庫呢?今天普健生物就在這里和大家一一介紹。

　　對于不同的公司來(lái)說(shuō)，納米抗體噬菌體文庫的構建是各不相同的，不過(guò)主要的區別在一些細節流程方面，大體的制備過(guò)程如下：

　　1、提取RNA。將我們提取的淋巴細胞溶解后轉移至新的離心管中，加入氯仿后混勻，離心15分鐘后轉至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，靜置10分鐘后再次離心10分鐘后，用75%的乙醇清晰沉淀，離心5分鐘后去除上清液，而后將其溶解質(zhì)無(wú)RNA酶的水中;

　　2、轉錄cRNA。將如上所得RNA一分為二，轉錄成cDNA;

　　3、擴增。將轉錄出的cDNA擴增到特定的抗體片段中;

　　4、克隆至噬菌體。將擴增所得的多樣化抗體基因序列和噬菌體進(jìn)行酶切，通過(guò)純化后進(jìn)行鏈接反應。而后再將所得DNA純化后回收，并使用超純水進(jìn)行溶解;

　　5、擴增和純化。將如上所得的噬菌體鏈接物進(jìn)行培養，按照輔助噬菌體數目20:1的比例加入輔助噬菌體后繼續培養30分鐘，加入濃度50ug/ml的卡那霉素，30度下?lián)u床培養。所得培養的菌體離心5分鐘后提取上清液，冰敷30分鐘后離心10分鐘并去除緩沖物中的溶解沉淀。再加入nacl后，冰上孵育10分鐘后離心15分鐘，最終得到噬菌體庫;

　　納米抗體噬菌體文庫構建的一些注意事項：

　　1、噬菌體文庫容量和多樣性是衡量文庫優(yōu)質(zhì)與否的重要因素，一般來(lái)說(shuō)，容量越大、多樣性越好，構建的噬菌體文庫質(zhì)量越佳;

　　2、在RNA提取的過(guò)程中，RNA的降解和反轉錄過(guò)程中模板、引物及其用量，擴增輪數、細菌轉化效率、連接體大小等因素我們都需要多注意一下;

　　總的來(lái)說(shuō)，噬菌體文庫構建成功與否，提取和擴增過(guò)程都是非常重要的，如果這幾步的操作不成功的話(huà)，會(huì )在極大程度上影響到抗體制備的成功與否。所以，對于我們來(lái)說(shuō)，只有做好這幾個(gè)方面的工作，才能在更大程度上促進(jìn)實(shí)驗的完成。普健生物專(zhuān)業(yè)為廣大用戶(hù)提供噬菌體文庫構建服務(wù)，如果您有相關(guān)需求，歡迎來(lái)電咨詢(xún)。