大腸桿菌原核蛋白表達的操作步驟和相關(guān)注意事項

　　采用大腸桿菌表達蛋白是現階段使用非常廣泛的一項技術(shù)，我們一般將這種方法稱(chēng)為原核表達。這個(gè)方法的使用范圍非常的廣泛，比如在蛋白純化、定位以及相關(guān)蛋白功能分析等。因為大腸桿菌易于控制和生長(cháng)，而且價(jià)格相對便宜，使得其使用極為廣泛。

　　大腸桿菌蛋白表達時(shí)，常常會(huì )使用載體(通常為質(zhì)粒)來(lái)表達目的蛋白。原核表達通常按照：獲得目的蛋白、構建表達載體、插入目的基因、培養宿主菌、誘導蛋白表達、蛋白分析，最后通過(guò)擴增、純化等操作后，進(jìn)行進(jìn)一步檢測;

　　其具體操作步驟如下：

　　1、獲得目的基因

　　獲得目的基因的方法主要有兩種，一種是PCR方法，一種是RT-PCR方法，另外一種是人工合成法。

　　PCR法：以含有目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，通過(guò)基因序列設計一對引物，從而獲得基因片段;

　　RT-PCR法：從細胞或組織中提取RNA，而后以RNA逆轉錄出cDNA第一鏈，而后以逆轉錄為模板獲得目的基因;

　　人工合成法：通過(guò)檢測到的目的基因序列，合成重疊的單鏈寡合苷酸，而后通過(guò)重疊延伸PCR法拼接出全長(cháng);

　　2、構建表達載體

　　使用限制性?xún)惹忻笇①|(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，而后對酶切的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，從而獲得載體大片段，而后通過(guò)相關(guān)技術(shù)手段將目的基因連入載體;

　　3、質(zhì)粒構建

　　將連接產(chǎn)物轉入大腸桿菌，而后對相關(guān)細菌進(jìn)行挑選，再然后通過(guò)裂解法提取質(zhì)粒，最后檢測目的基因的插入方向并論證其正確性;

　　4、誘導表達

　　對含有目的基因的菌體進(jìn)行培養，而后取部分液體與未誘導組進(jìn)行對照，培養完成后，離心后取上清液作為樣品;

　　大腸桿菌蛋白表達的注意事項有哪些?

　　1、在我們選擇表達載體時(shí)，一定要根據蛋白的最終應用來(lái)進(jìn)行選擇;

　　2、在進(jìn)行外源DNA連接時(shí)，需要確保其轉錄與轉移過(guò)程中不會(huì )出現相互干擾的情況;

　　大腸桿菌蛋白表達作為現階段使用最為廣泛的原核蛋白表達系統，因為其遺傳背景清晰的優(yōu)勢，在蛋白表達上有著(zhù)極大的優(yōu)勢。在進(jìn)行相關(guān)蛋白表達時(shí)，需要嚴格按照實(shí)驗標準來(lái)操作，這樣才能在更大程度上保證蛋白的表達。武漢普健生物專(zhuān)業(yè)為廣大用戶(hù)提供原核蛋白表達服務(wù)，如果您有相關(guān)需求，歡迎來(lái)電咨詢(xún)。