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一、需求分析
客戶(hù)需求：可提供蛋白序列，希望得到純度85%左右的500μg蛋白，蛋白后續用于酶活實(shí)驗，項目預算有限，后期可能需要大量蛋白。
需求分析
如項目預算有限，建議優(yōu)先選擇原核表達系統，成本較為低廉，如后續需要進(jìn)行大體積放大，可直接進(jìn)行發(fā)酵，工藝成本更低;對于酶的表達，普健的大腸桿菌表達系統在已往項目中有較為積極的客戶(hù)反饋; 基于以上分析，普健建議該項目選用大腸桿菌表達系統。
二、蛋白性質(zhì)分析
將蛋白序列在蛋白數據庫Uniport中比對，一致性較高為80.9%，用生物信息學(xué)工具進(jìn)行蛋白性質(zhì)分析。
跨膜結構域預測：
信號肽預測：
疏水性預測：
蛋白性質(zhì)總結：客戶(hù)提供蛋白序列一共234 AAs，蛋白大小為25.39 KDa，pI為8.80，疏水性一般，無(wú)跨膜結 構域，無(wú)信號肽，無(wú)糖基化及二硫鍵修飾。
三、實(shí)驗設計
綜合蛋白性質(zhì)及客戶(hù)需求分析，設計蛋白表達方案如下：選擇大腸桿菌表達系統，表達目的蛋白全長(cháng)，N端融合6*His標簽，表達載體為pET28b，選用BL21(DE3)、T7E為表達菌株，設置多個(gè)誘導溫度及誘導時(shí)間，根據表達測試結果，選擇最優(yōu)條件進(jìn)行200mL放大，收集樣品采用Ni柱純化，交付蛋白樣品。
四、實(shí)驗方法及實(shí)驗結果
1、表達載體構建
利用生物信息學(xué)工具對目的蛋白全長(cháng)片段進(jìn)行密碼子優(yōu)化，降低稀有密碼子水平，用化學(xué)合成方法獲得目的蛋白基因序列片段，將片段亞克隆到pET28b表達載體，進(jìn)行雙酶切驗證及測序確認。進(jìn)行雙酶切驗證及測序確認。
測序結果：
雙酶切驗證結果：
結果分析：NdeI/XhoI雙酶切測試結果顯示片段大小正確，測序結果顯示序列一致，確認蛋白表達載體構建成功。
2、表達測試
將表達載體轉化至BL21(DE3)菌株、T7E菌株，挑取陽(yáng)性克隆轉移到含Kana抗性的LB培養基上，37℃培養3-4h，加入1mM IPTG誘導表達，一組37℃培養4h，另一組16℃培養16h過(guò)夜，收集蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測。
SDS-PAGE結果：
結果分析：根據SDS-PAGE結果，蛋白大小在25KD左右，與預測蛋白大小相符，比較各條件下蛋白表達情況，確認該蛋白最優(yōu)的表達條件如下：
| 菌株 | 溫度 | 誘導時(shí)間 |
| T7E 菌株 | 37℃ | 4h |
3、放大純化
按照得到的最優(yōu)表達條件，轉化200mL大腸桿菌，37℃培養3-4h，1mM IPTG誘導后，37℃培養4h，收集蛋白樣品，用Ni柱進(jìn)行蛋白純化，得到最終蛋白樣品。
4、QC檢測
將最終得到的蛋白樣品進(jìn)行濃度測定、SDS-PAGE檢測及His標簽抗體的WB檢測。
SDS-PAGE檢測及WB檢測結果：
結果分析：SDS-PAGE結果顯示蛋白大小在25KD左右，且蛋白純度較好，約為95%; His標簽抗體的WB檢測結果顯示25KD左右曝出條帶，與目的蛋白預測大小相符。
五、交付材料
| 序號 | 樣品 | 濃度 | 分裝 | 緩沖液 | 管數 |
| 1 | 蛋白 | 1.00mg/ml | 1.50ml/管 | PBS pH7.5 | 2管 |
| 2 | 表達載體 | 100ng/ul | 15ul/管 | TE | 1管 |
| 3 | 表達菌株 | / | 1.00ml/管 | / | 1管 |
| 合計管數: | 4管 | ||||
六、項目結題
從基因合成到交付蛋白樣品，項目為期5周，得到3.00mg目的蛋白樣品，由于酶活測試的多樣性與特殊性，交付給客戶(hù)進(jìn)行驗收及酶活測試，客戶(hù)驗證蛋白大小純度均與QC結果一致，酶活實(shí)驗結果表明蛋白有生物活性，綜上，項目順利結題。
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